Влияние концентрации фермента

При условии избытка субстрата скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. Эта зависимость подчиняется уравнению прямой.

V

 

 

[Е] – концентрация фермента

 

 

[Е]

Это значит, что удвоение количества фермента удваивает активность и т.д.; так что по измеряемой активности можно оценить количество фермента. Именно в зоне реакции нулевого порядка достигается пропорциональность между активностью фермента и его количеством. Такая зависимость имеет важное значение в клинико-биохимической диагностике тех патологических состояний, когда ферменты из поврежденных тканей попадают в кровь. Однако пропорциональность между активностью фермента и их количеством может быть нарушена под влиянием ингибиторов или активаторов. Поэтому, измеряя активность фермента, судят только об его активности. О количестве фермента можно делать выводы только с учетом кинетики активности.

 

 

Влияние температуры.

Известно, что скорость химической реакции увеличивается в 2 раза при повышении температуры на 10ºС. Однако, из-за белковой природы ферментов, повышение температуры приведет к тепловой денатурации фермента и снижению скорости реакции. Оптимальная температура – это та температура, при которой скорость реакции максимальна. Для ферментов теплокровных – это 37ºС, для большинства ферментов оптимальной температурой является 35-40ºС.

При температуре 50-60ºС скорость реакции снижается, так как начинается денатурация фермента, при 20-30ºС наблюдается увеличение скорости ферментативной реакции. Поскольку стабильность отдельных ферментов при нагревании различна, этот факт находит практическое применение при выделении и очистке ферментов. В смеси ферментов с различной температурной чувствительностью можно измерить активность более устойчивого к нагреванию фермента, если предварительно нагреть смесь до температуры, разрушающей другие ферменты этой смеси. Так, в клинической практике, удается разделить разные изоферменты ЛДГ. Например, специфический для сердца изофермент ЛДГ₁ значительно менее чувствителен к нагреванию, чем другие изоферменты. Поэтому после нагревания реакционной смеси остаточная активность ЛДГ отражает активность ЛДГ₁ миокарда, а специфичные для мышц и печени ферменты при этом разрушаются.

Влияние рН среды.

У каждого фермента существует свой рН-оптимум – это узкий диапазон измерения рН среды для оптимального действия ферментов. Например, пепсин желудочного сока, катализирующий гидролиз белков, имеет рН-оптимум при 1,5. При рН 3,0 он теряет половину активности, а при рН 4,0 активность фермента не определяется. рН-оптимум амилазы, расщепляющей крахмал составляет 6,8 – 7,0. Изменение рН на единицу приводит к снижению активности амилазы на 50%, а при изменении на две единицы отмечается полная потеря активности. Для большинства ферментов крови оптимум рН – 7,4.

 

Активность ферментов, а значит и скорость химической реакции, можно регулировать, изменяя следующие параметры:

1) абсолютное количество фермента;

2) условия протекания реакции (рН, t, р), количество субстрата, наличие активаторов, ингибиторов;

3) каталитическую эффективность фермента.

Абсолютное количество фермента в клетке определяется скоростями его синтеза и распада. В клетке существует 2 вида ферментов: 1. Конститутивные ферменты – всегда присутствуют в клетках данного организма. Они являются обязательными компонентами клетки, синтезируются с постоянной скоростью в постоянных количествах. 2. Адаптивные ферменты – их образование зависит от условий, складывающихся в клетке. Среди них выделяют индуцируемые и репрессируемые ферменты.

Индуцируемыми обычно бывают ферменты с катаболической функцией. Их образование может быть вызвано или ускорено субстратом данного фермента.

Репрессируемыми обычно бывают анаболические ферменты. Ингибитором синтеза ферментов может быть конечный продукт данной ферментативной реакции.

Чтобы достигнуть повышения активности путем увеличения количества фермента, следует активировать процессы синтеза белков. Этот процесс называют индукцией. Такая индукция ферментов у высших животных осуществляется при помощи гормонов. Взаимодействуя с клетками, гормоны оказывают влияние на процессы синтеза белков. Выделение гормонов из мест их образования, желез внутренней секреции, происходит в ответ на изменение концентрации субстратов – это своеобразный сигнал необходимости перестройки ферментативной активности. Если, например, в организме снижается уровень глюкозы, то компенсаторно активируются процессы синтеза глюкозы из других веществ, в данном случае – из белков. Синтез необходимых для этого ферментов стимулируется путем выделения гормонов надпочечников (глюкокортикоиды). Восстановление нормальной концентрации метаболитов приводит к снижению выделения гормона, уменьшается индукция и тем самым количество ферментов. При помощи механизмов индукции быстрая регуляция невозможна. Эта система включается как ответ на длительно действующие изменения метаболизма.

На активность фермента оказывают влияние эффекторы – активаторы и ингибиторы. Измеряемая активность в присутствии одного и того же количества фермента повышается при добавлении положительных эффекторов и снижается при добавлении отрицательных по сравнению с реакцией, протекающей без эффектора. Подобное влияние имеет важное значение как в условиях исследований in vitro, так и в организмах (in vivo). Для проведения ферментативных реакций необходимо использовать тщательно очищенные вещества. Если, например, на стенках пробирки даже после тщательного промывания остается бихромат, это может нарушить работу фермента.

В организме эффекторы регулируют активность ферментов, т.е. обратимо изменяют их функциональное состояние, при этом ключевые реакции могут или тормозиться, или стимулироваться. Ионы металлов ускоряют связывание субстрата или активизируют конформацию активного центра (микроэлементы – Мn, Zn, Со, Sе и др., ионы – Са²⁺, Мg²⁺, Nа⁺, К⁺).

Органические соединения действуют часто как тормозящие вещества (ингибиторы).

Ингибиторы, взаимодействуя с ферментом, препятствуют образованию нормального фермент-субстратного комплекса, уменьшая тем самым скорость реакции или прекращая её.

	Классификация ингибиторов ферментов

 

Неспецифические ингибиторы вызывают денатурацию ферментов (соли тяжелых металлов, кислоты, щелочи). Их действие не связано с механизмом ферментативного катализа.

Специфические ингибиторы – их действие связано с механизмом ферментативного катализа.

При необратимом ингибировании образуется прочный комплекс фермента и ингибитора, и фермент частично или полностью теряет свою активность. Даже если удалить свободный ингибитор из среды, то часть молекул фермента, которая успела связаться с ингибитором, остается угнетенной длительное время. Например, дыхательные яды – НСN, КСN, СО – они меняют валентность Fе и Сu, входящих в состав ферментов дыхательной цепи, препятствуя переносу электронов на О₂.

В случае обратимого действия ингибитор образует с ферментом непрочный комплекс, способный распадаться, в результате чего снова возникает активный фермент. Обратимые ингибиторы бывают конкурентные и неконкурентные.

 

С позиции ферментативной кинетики следует различать конкурентное и неконкурентное торможение.

В случае конкурентного торможения регуляторы похожи на субстрат, поэтому они пытаются «перехитрить» фермент, связываясь с его активным центром. Возникает неактивный фермент-субстратный комплекс, который блокирует некоторое количество фермента. Торможение можно устранить избытком субстрата. Этот принцип широко используется клеткой, потому что наиболее похожим по структуре на субстрат может быть продукт реакции, а его накопление по конкурентному механизму будет тормозить активность фермента. Многие лекарственные препараты специфически тормозят активность ферментов потому, что они похожи на субстрат. Хороший ингибирующий эффект достигается путем регулярного приема такого вещества (поддержание терапевтической концентрации). Такой способ торможения называют изостерическим.

Тормозящее действие других веществ является неконкурентным, т.е. ингибитор присоединяется к энзиму не в том месте (или не только в том месте), с которым связывается субстрат. В таких случаях при увеличении концентрации субстрата энзим не освобождается от блокирующего действия. О таком торможении говорят как об аллостерическом торможении. Фермент, ингибируемый таким образом, называют аллостерическим. Наряду с центром связывания субстрата фермент имеет дополнительное место для связывания эффектора, которое называется аллостерическим центром. Аллостерический центр пространственно отделен от собственно каталитической единицы, в которой располагается активный центр. В результате изменяется структура всего фермента, и активный центр теряет способность присоединять субстрат.

Аллостерическое торможение имеет большое значение для регуляции обмена веществ.

а) конкурентное ингибирование

а

[J]>[S] +

ЕJ S

+ + [S]>[J] б

Е S J ЕS J

+

Е Р₁ Р₂

б) неконкурентное ингибирование

 

аллостерический

центр

 

 

активный центр

Е – фермент, S – субстрат, J – ингибитор.

 

Аллостерическая регуляция ферментов основана на принципах связывания аллостерического эффектора. Возможно взаимодействие фермента с положительными и отрицательными эффекторами, не исключается также одновременное связывание нескольких эффекторов. Может быть и обратный эффект. Связывание субстрата в активном центре изменяет конформацию и на регуляторном центре. В результате снижается аффиность (сродство) фермента к эффектору. В этом случае идет своеобразная конкуренция между субстратом и эффектором, в результате которой действие эффектора может быть снять высокими концентрациями субстрата. В этом случае действие эффектора зависит от его же количества. Если, например, конечный продукт ферментативного процесса действует на фермент как естественный аллостерический эффектор, то при повышении концентрации конечного продукта наступает торможение превращения субстрата, а это приводит к накоплению субстрата, что создает неблагоприятные условия для связывания эффектора, и превращение субстрата продолжается. Аллостерическая регуляция протекает чаще всего по принципу обратной связи. Конечный продукт цепи превращений тормозит ключевой фермент в начале цепи, т.е. вся цепь реакций регулируется конечным продуктом (например при синтезе жирных кислот).

 

 

Е₁ Е₂

А В С Д

 

Возможны также разнонаправленные влияния одного и того же эффектора на различные цепи химических превращений. Так действует, например, цитрат. Он является негативным эффектором окисления глюкозы до ацетил-КоА. Одновременно он выступает в качестве положительного эффектора при использовании ацетил-КоА для процессов синтеза жирных кислот.

 

Глюкоза → А → В → → ацетил-КоА → Х → У → Z → жирные кислоты

Цитрат

Тогда при чрезмерном распаде глюкозы накопление цитрата будет тормозить окисление глюкозы и одновременно усиливать образование жирных кислот, тем самым увеличивается синтез нейтрального жира, который откладывается в депо.

При изменении функционального состояния ферментов возможна быстрая, тонкая регуляция активности.

Химическая модификация ферментов ведет к очень быстрому изменению их функционального состояния. Она заключается в ограниченном химическом изменении молекул фермента, и включает в себя введение или удаление небольшой группы атомов в молекуле фермента. Чаще всего это фосфорилирование или дефосфорилирование ферментов, или окисление SН-группы. Функциональное состояние фермента до реакции отличается от такого после реакции. Чаще всего в одной форме фермент неактивен. Обе формы модифицированного фермента обозначается буквами «а» и «в». химическое изменение фермента в другую форму осуществляется вспомогательным ферментом. Для прямой и обратной реакций необходимы разные вспомогательные ферменты.

 

вспомогательный

Форма фермента «в»

Форма фермента «а»

фермент 1

вспомогательный

фермент 2

 

Эти вспомогательные ферменты регулируются модифицирующими эффекторами, которые чаще всего появляются в ответ на гормональный сигнал. В качестве такого эффектора чаще выступает цАМФ. Влияние модифицирующих эффекторов сохраняется в противоположность аллостерическому эффектору даже после их исчезновения. В этом случае для возвращения фермента в исходное состояние необходим новый эффектор. Так как регуляция вспомогательных ферментов также является ферментзависимым процессом, в ряде случаев возникают каскадные реакции в качестве тонких механизмов регуляции метаболизма.

эффектор

фермент а₁ фермент в₁

 

фермент а₂ фермент в₂

фермент а фермент в

 

Каскадные реакции – это цепь реакций с использованием вспомогательных ферментов, которые регулируются модифицирующими эффекторами в ответ на гормональный сигнал. Такие формы регуляции важны для активационного контроля мультиэнзимных комплексов. «Мультиферментные комплексы» – это комплексы энзимов, которые включают несколько ферментов в одной структурной единице. Ферменты этого комплекса катализируют все этапы распада одного вещества до его конечных продуктов или образование вещества из исходных соединений. Примером может служить дыхательная цепь ферментов в мембране митохондрий или комплекс ферментов синтеза жирных кислот в цитозоле; рибосомы являясь структурными элементами клеток, включают набор ферментов для трансляции. С помощью химической модификации можно регулировать функции мультиэнзимных комплексов.

 

Лекция № 12.

ТЕМА «ФЕРМЕНТЫ».

1. Классификация и номенклатура ферментов.
2. Условия проведения ферментативной реакции и определения активности ферментов в лабораторной практике.
3. Локализация ферментов в клетке.
4. Энзимопатии.
5. Энзимодиагностика. Биологическое и клиническое значение ферментов.
6. Метаболическая терапия, использование в ней ферментов (заместительная терапия, иммобилизованные ферменты).

Международный биохимический союз разработал единые требования к названиям ферментов и единую классификацию. В основе классификации лежит химическая характеристика реакций, катализируемых ферментами или химическая природа субстрата, подвергающегося превращению. Выделяют 6 классов.

1. Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции (дегидрогеназы, оксигеназы, оксидазы). Например, ЛДГ обеспечивает окисление и восстановление молочной кислоты; ксантиноксидаза катализирует синтез мочевой кислоты.

2. Трансферазы – катализируют перенос групп между субстратами (аминотрансферазы: АсТ, АлТ и др.).

3. Гидролазы – катализируют реакции расщепления при участии воды (пепсин, трипсин).

4. Лиазы – катализируют реакции отщепления групп с образованием двойных связей или присоединением групп по месту двойных связей. Например, декарбоксилазы – катализируют отщепление СО₂.

5. Изомеразы – катализируют реакции внутримолекулярной перестройки. Например, глюкозофосфатизомераза обеспечивает прямую и обратную реакцию между фруктозо-6-фосфатом и глюкозо-6-фосфатом.

6. Лигазы (синтетазы) – участвуют во всех реакциях синтеза (трансляция белка – синтетаза ДНК-аза, РНК-аза и др.).

Название фермента составляется по названиям субстрата, кофермента, типа реакции:

 

Глюкозо-6-фосфат – фосфогидролаза

субстрат продукт тип окончание

реакции реакции «аза»

(Н₃РО₄)

Старые названия, прочно укоренившиеся в литературе: пепсин, амилаза, трипсин и др.

Международный союз биохимиков опубликовал каталог ферментов, в котором отдельные ферменты расположены по классам и подклассам, с указанием шифра. Например, ЛДГ, навое название НАД⁺ - оксидоредуктаза (к.ф.1.1.1.27).

 

В диагностике заболеваний определению активности ферментов придается большое значение. Оптимальные условия проведения ферментативной реакции:

1) установление рН-оптимума фермента путем использования соответствующего буферного раствора с гарантией поддержания рН на постоянном уровне во время реакции;

2) удаление из зоны реакции ингибирующих веществ;

3) поддержание постоянной температуры во время проведения реакции;

4) добавление в достаточном количестве коферментов;

5) обеспечение избытка субстрата.

Избыток субстрата гарантирует измерение максимальной скорости реакции и устраняет падение активности фермента из-за потребления субстрата. Условия проведения реакции должны строго соблюдаться. Помимо определения активности ферментов с диагностической целью, имеет значение и определение количества субстратов с помощью препаративно изолированных ферментов. Для этого к определенному субстрату добавляют избыток фермента в оптимальных для реакции условиях. Затем полученный продукт определяют специальными методами.

Например, использование фермента в реакциях превращения глюкозы основано на свойстве субстратной специфичности и исключает участие в химической реакции других сахаров. В этом случае определяется концентрация только глюкозы. Ферментативными методами определяют концентрацию ТАГ, мочевины, холестерина и др. субстратов.

Ферменты неравномерно распределены внутри клеток. Они связаны с определенными структурами и местами в клетке, которые выполняют определенную роль в обмене веществ и тесно взаимосвязаны друг с другом. Многие ферменты тесно связаны со структурными белками в данном отсеке клетки. В некоторых случаях едва ли возможно различить белок фермента и структурный белок. Такая жесткая фиксация ферментов со структурными образованиями клетки характерна не для одного, а для целой группы ферментов, которые катализируют цепь метаболических превращений. Ферменты и структурные белки тесно связаны в митохондриях. Во внутренней мембране локализованы функциональные единицы – комплексы ферментов дыхательной цепии окислительного фосфорилирования. Они обеспечивают получение и накопление энергии. Комплексы реакций окисления жирных кислот и цикла Кребса протекают также в митохондриях. Таким образом, в митохондриях сосредоточен целый ряд мультиферментных комплексов. Тесный контакт ферментов и субстратов в мультиферментных комплексах благоприятствует быстрому протеканию реакций.

Первичные лизосомы, пузырьковые образования, содержимое которых состоит из ферментов, катализирующих распад клеточных составных частей. Неконтролируемое действие этих ферментов после разрушения первичных лизосом может привести к растворению клетки. В нормальных условиях действие лизосомных ферментов контролируется. При повреждении клеток и после их гибели ферменты выходят из первичных лизосом и вызывают растворение клетки (аутоцитоз). Мембраны ЭПС содержат ферменты для синтеза ТАГ и сложных липидов.

Гиалоплазма (цитозоль) – жидкое содержимое клеток, которое омывает все органеллы и заключено в мембрану. Там происходит синтез и распад углеводов, синтез жирных кислот, ряд подготовительных реакций для получения энергии в митохондриях.

Пространственное разделение различных реакций обмена внутри клеток обусловливает необходимость транспорта в ней промежуточных метаболитов. Так, например, окислительный распад углеводов до СО₂ и Н₂О идет частично в цитозоле, частично в митохондриях. Наоборот, строительный материал для синтеза жирных кислот должен доставляться из митохондрий в цитозоль. Неконтролируемый переход веществ через мембрану митохондрий невозможен. Для таких целей существуют многочисленные транспортныемеханизмы, в которых важную роль выполняют переносчики – вещества, которые являясь частью мембраны или будучи не связанными с ней веществом, обеспечивают управление проницаемостью мембран для определенных субстратов. Примером такого переноса является поставка в митохондрию жирных кислот с участием карнитина. В обмене веществ все метаболические пути в каких-либо пунктах соприкасаются или перекрещиваются. Примером такой взаимосвязи между различными отделами клеток могут служить процессы синтеза белков.