Определение показателей безопасности продуктов проводится в соответствии с ГОСТ 9958-81 "Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологическтго анализа".
Данный стандарт устанавливает методы бактериологического анализа:
- Определения общего количества микроорганизмов;
- определения бактерий группы кишечной палочки;
- определения бактерий из рода сальмонелл;
- определения бактерий группы протея;
- определения коагулазоположительных стафилококков;
- определения сульфитвосстанавливающих клостридий.
Определение общего количества микроорганизмов в 1 г продукта
Метод не распространяется на сырокопченые колбасы. Сущность метода заключается в способности мезофильных аэробов и факультативных анаэробов расти на питательном агаре при температуре 30±0,5°С с образование колоний, видимых при увеличении.
Из каждой пробы должно быть сделано не менее 2 посевов, различных по объему, взятых с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При этом на одну чашку Петри проводят посев 0,1 г, а на другую - 0,01 г продукта. На чашки Петри наносят наименование анализируемого продукта, дату посева и количество посеянного продукта.
После внесения разведенной анализируемой взвеси в чашки Петри, чашку заливают 12-15 см3 расплавленного и охлажденного питательного агара. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, не залитых участков дна чашки Петри, попадания среды на края и крышку чашки.
Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с пятикратным увеличением или специальным прибором с лупой.
Для определения общего количества микроорганизмов в 1 г продукта подсчитанное количество колоний умножают на степень разведения анализируемого продукта.
За окончательный результат определения количества бактерий в 1 г анализируемого продукта принимают среднеарифметическое значение результатов подсчета двух чашек разной массы продукта.
Определение бактерий группы кишечной палочки в 1 г продукта
Сущность метода заключается в способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять глюкозу и лактозу. При этом в средах "ХБ", Хейфеца и КОДА образуются кислые продукты, меняющие цвет индикаторов, а в среде "Кесслер" в поплавке образуется газ вследствие расщепления глюкозы.
Цель определения этой группы бактерий - проверка соблюдения режима при варке колбас.
При микробиологическом контроле колбасных изделий в производственных лабораториях можно ограничиваться обнаружением бактерий из группы кишечной палочки без их биохимической идентификации.
В пробирки, содержащие по 5 куб. см среды "ХБ", среды Хейфеца двойной концентрации или среды КОДА, вносили по 5 куб. см испытуемой взвеси стерильной пипеткой вместимостью 5-10 куб. см с широким концом. Допускается применение среды Кесслер по 10 куб. см.
Пробирки со средами "ХБ", Кесслер, Хейфеца и КОДА поместили в термостат с температурой 37°С на 18-20 часов.
При росте бактерий группы кишечной палочки среды "ХБ" и КОДА окрашивалась в желтый цвет, среда Хейфеца приобретала также желтый цвет, который может меняться до салатно-зеленого, на среде Кесслер в поплавке образуется газ.
Для окончательного заключения о присутствии в продукте бактерий группы кишечной палочки проводили высев со среды Кесслер (забродившие пробирки) или Хейфеца (изменившие цвета среды) в чашки Петри со средой Эндо или Плоскирева, или Левина. Чашки Петри помещали в термостат с температурой 37°С. Через 18-20 часов посевы просматривали. На среде Эндо бактерии группы кишечной палочки образуют темно-красные колонии с металлическим блеском или розово-красные без блеска, на среде Плоскирева - кирпично-красные с глянцевой поверхностью, на среде Левина - темно-фиолетовые колонии или фиолетово-черные блестящие. Из подозреваемых колоний готовили мазки, которые окрашивали по Граму.
Специфическое изменение среды "ХБ" и КОДА не требует дальнейшего подтверждения.
При заведомо высокой обсемененности анализируемый продукт массой не более 0,25 г помещали в пустую пробирку, в которую закладывали комочек стерильной фильтрованной бумаги размером 5×5 см, и стерильной стеклянной палочкой или фламбированной проволокой подталкивали материал до дна (не уплотняя), в пробирку наливали среду "ХБ", КОДА или Хейфеца (нормальной концентрации), заполняя ее на 3/4 высоты пробирки. Пробирки помещали в термостат с температурой 37°С. на 8-10 часов. При росте бактерий группы кишечной палочки на среде Хейфеца среда изменяет свой цвет из красно-фиолетового в желтый, который затем может меняться до салатно-зеленого.
Обнаружение грамотрицательных палочек, специфически изменяющих цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, указывает на наличие бактерий группы кишечной палочки.
Определение бактерий из рода сальмонелл в 25 г продукта
Сущность метода заключается в определении характерного роста сальмонелл на элективных средах и установлении биохимических и серологических.
Навеску продукта массой 25 г от объединенной пробы вносили во флакон Сокслета, содержащий 100 куб. см среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористомагниевой среды М). Жидкость во флаконе должна подняться до метки 125 куб. см. Флаконы тщательно встряхивали и помещали в термостат с температурой 37°С. Через 16-24 ч после тщательного перемешивания с помощью бактериологической петли (диаметр 0,4-0,5 мм) или пастеровской пипетки проводили посев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо, БФА, Плоскирева, Левина или висмут-сульфит-агар (по выбору).
Чашки с посевами помещали в термостат с температурой 37°С; посевы просматривали через 16-18 часов. На среде Эндо бактерии из рода сальмонелл образуют бесцветные или с розовым оттенком колонии.
На среде БФА сальмонеллы образуют крупные, гладкие, красноватого оттенка прозрачные колонии (колонии сальмонеллы тифи суис, как и на среде Эндо - мелкие). Бактерии группы кишечной палочки образуют колонии желто-зеленоватого цвета. Бактерии группы протея дают рост через 72 часа.
На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде бесцветных колоний, но колонии более плотные и несколько меньшего размера, чем на среде Эндо.
На среде Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных, бледных нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.
На висмут сульфитном агаре сальмонеллы растут в виде черных или коричневых колоний с характерным металлическим блеском. При том наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют некоторые серологические типы из группы С, которые на этой среде растут в виде нежных светло-зеленых или серовато-зеленых колоний.
Изолированные колонии, характерные для бактерий из рода сальмонелл, пересевали на трехсахарный агар Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик. Посевы помещали на 12-16 часов в термостат с температурой 37°С.
При росте бактерий из рода сальмонелл цвет скошенной поверхности среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука - розовый, столбик - желто-бурый; газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, сероводородообразующие - вызывают потемнение столбика.
Другие грамнегативные бактерии дают следующие изменения цвета среды:
- Бактерии группы кишечной палочки - вся среда окрашивается в синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без него;
- Бактерии из группы протея - среда окрашивается в ярко-красный цвет, может образоваться черный осадок;
- Шигеллы и возбудители брюшного тифа - косяк окрашивается в розовый цвет, столбик - в синий, или сине-зеленый.
Допускается вместо среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука посев на углеводные среды в короткий пестрый ряд, включая среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, и мальтозой, полужидкий агар уколом (для определения подвижности) и бульон Хоттингера для определения образования индола и сероводорода.
Для дальнейшей идентификации бактерий готовили мазки, которые окрашивали по Граму, микроскопировали и изучали серологические свойства микроорганизмов путем постановки пробной агглютинации на предметном стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной О-сывороткой. При получении положительной реакции на стекле с поливалентной сывороткой проводили идентификацию с помощью монорецепторных агглютинирующих О-сывороток.
Установив серологическую группу, к которой относятся исследуемые бактерии, с помощью Н-сывороток определяли тип бактерий.
Обнаружение подвижных (кроме S. Pullorum & S. Gallinarum) грамотрицательных палочек, дающих характерный рост на элективных средах, неферментирующих лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа (S. typhi suis не ферментирует маннит), дающих положительную реакцию агглютинации с монорецепторными О - и Н-сальмонеллезными сыворотками, указывает на наличие бактерий из рода сальмонелл.
Определение бактерий группы протея
Сущность метода заключается в определении морфологии и роста на питательных средах, способности гидролизировать мочевину и образовывать сероводород.
Для подтверждения наличия роста протея в Н-форме 0,5 куб. см анализируемой взвеси вносили в конденсационную воду свежескошенного мясопептонного агара, разлитого в широкие пробирки, не касаясь среды (метод Шукевича). Вертикально поставленные пробирки помещали в термостат с температурой 37°С. Через 18-24 ч посевы просматривали. Обращали внимание на образование ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком; на скошенном мясопептонном агаре культура поднимается из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды. При появлении характерного роста микробов рода протея, микроскопировали окрашенные по Граму мазки и изучали подвижность микробов в раздавленной или висячей капле.
Для обнаружения нероящихся О-форм можно проводить посев на поверхность агара Плоскирева. О-форма протея растет на этой среде в виде прозрачных колоний, слегка подщелачивающих среду, окрашивая ее в желтый цвет. Делали пересев материала из подозрительных колоний в среду Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука, где при наличии бактерий из группы протея среда окрашивается в ярко-красный цвет (вследствие расщепления мочевины) и может образовываться черный осадок с возможным разрывом агарового столбика (вследствие образования сероводорода).
Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, образующих характерный рост на средах в Н-форме (подвижные) и О-форме (неподвижные), ферментирующих глюкозу и мочевину, неферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие бактерий из рода протея.
Определение коагулазоположительных стафилококков
Сущность метода заключается в определении морфологии, характера роста на питательных средах и в способности отдельных стафилококков ферментировать лецитиназу и коагулировать цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.
Из разведения анализируемой взвеси продукта (1/10) проводили посевы на молочно-солевой агар, содержащий 6,5% хлористого натрия, для выявления пигмента или желточно-солевой агар, содержащий 6,5% хлористого натрия, для выявления лецитиназной активности.
Взвесь наносили на поверхность агара в количестве 0,2 куб. см и равномерно растирали по всей поверхности агаровой среды.
Посевы термостатировали в течение 24 ч при температуре 37°С и 24 ч выдерживали при комнатной температуре.
На поверхности питательной среды колонии стафилококка имеют вид плоских или слегка выпуклых блестящих колоний с ровным краем. При этом на молочно-солевом агаре лучше выявляется пигмент (эмалево-белый или золотистый), а на желточно-солевом агаре колонии стафилококков могут образовывать "радужный венчик", что является одним из признаков их патогенности.
Из подозрительных колоний готовили препараты, которые окрашивали по Граму. При наличии стафилококков в препарате обнаруживаются грамположительные мелкие кокки, располагающиеся неправильными гроздьями.
Для подтверждения признаков патогенности стафилококков ставили реакцию плазмокоагуляции. В прибор с 0,5 куб. см цитратной плазмы крови кролика, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1/4, вносили петлю чистой суточной культуры стафилококка и ставили в термостат при температуре 37°С. Реакцию плазмокоагуляции учитывали через 3-4 ч (не встряхивая пробирку) и оставляли в термостате на сутки для окончательного учета через 24 ч.
Для постановки реакции плазмокоагуляции можно использовать также сухую цитратную плазму крови кролика. Реакцию считают положительной, если плазма коагулируется в сгусток.
Для определения количества стафилококков учитывали колонии стафилококков, давшие положительную реакцию плазмокоагуляции. При расчете на 1 г продукта количество подсчитанных колоний умножают на степень разведения и делят на количество посевного материала.
Определение клостридий перфрингенс (сульфит-восстановителей)
Сущность метода заключается в специфическом росте клостридий перфрингенс в средах СЦС или Вильсон-Блера, на которых в результате восстановления сернистокислого натрия в сернокислый натрий происходит взаимодействие с хлористым железом и образуется почернение среды за счет сернистого железа.
Проведение анализа на среде Вильсон-Блера. В пробирки, содержащие по 9 куб. см расплавленной и охлажденной до температуры 45°С среды Вильсон-Блера, вносили стерильной пипеткой по 1 куб. см десятикратных разведений (от 1/10 до 1/1000000) взвеси испытуемого продукта. Посевной материал и среду тщательно перемешивали. Посевы поместили в термостат с температурой 46°С на 8-12 ч. Появление в среде черных колоний или почернение всей среды указывает на присутствие сульфит-редуцирующих клостридий.
За положительный титр клостридий (сульфит-восстановителей) принимают то максимальное разведение суспензий, в посеве которого произошло почернение среды
Основные пороки и дефекты
Загрязнение батонов (сажей, пеплом) - обжарка влажных батонов, использование смолистых пород дерева при обжарке.
Оплавленный шпик и отеки жира под оболочкой - использование мелкого шпика; преждевременная закладка шпика в мешалку; высокая температура при обжарке, варке.
Слипы - соприкосновение батонов друг с другом во время обжарки.
Отеки бульона под оболочкой - низкая водосвязывающая способность фарша; использование мороженого мяса длительного срока хранения и мяса с высоким содержанием жира; недостаточная выдержка мяса в посоле; перегрев фарше при измельчении (куттеровании) изменение количества добавленной воды при составлении фарша; несоблюдение последовательности закладки сырья в куттер.
Лопнувшая оболочка - излишне плотная набивка батонов при шприцевании; варка колбас при повышенной температуре; недоброкачественная оболочка.
Прихваченные жаром концы - высокая температура при обработке; загрузка в камеру батонов неодинаковых по длине.
Морщинистость оболочки - неплотная набивка батонов; охлаждение вареных колбас на воздухе, минуя стадию охлаждения водой под душем.
Серые пятна на разрезе и разрыхление фарша - низкая доза нитрита; недостаточная продолжительность выдержки мяса в посоле; высокая температура помещения для посола; задержка батонов после шприцевания в помещении с повышенной температурой; удлинение обжарки при пониженной температуре в камере; увеличение интервала времени между обжаркой и варкой; низкая температура в камере в начальный период варки; использование прогорклого шпика.
Неравномерное распределение шпика - недостаточная продолжительность перемешивания фарша.
Пустоты в фарше - слабая набивка фарша при шприцевании; недостаточная выдержка батонов при осадке.
Наличие в фарше кусочков желтого шпика и прогорклый вкус шпика - использование шпика с признаками окисленной порчи.
Слизь или плесень на оболочке, проникновение плесени под оболочку - недостаточная обработка батонов дымом при обжарке; несоблюдение режимов хранения колбас (повышение температуры и относительной влажности воздуха).
