Найважливіші біохімічні процеси, збудниками яких є мікроорганізми

Мікроорганізми в процесі своєї життєдіяльності, тобто в процесі обміну речовин, утворюють різні продукти: спирти (етиловий, бутиловий, ізоаміловий), кислоти (молочну, оцтову, масляну, пропіо­нову), різні антибіотики, вітаміни та інші продукти. Багато про­дуктів, які утворюються мікроорганізмами, широко використо­ву­ються в народному господарстві. Отримання спирту, молочної, лимонної, оцтової кислот та різних антибіотиків базується на використанні жит­тє­діяльності мікроорганізмів. На використанні біохімічних процесів, які збуджуються мікроорганізмами, ґрунтується вироб­ництво вина, пива, квасу, бродіння тіста, різних кисломолочних продуктів, ква­шених овочів та ін. Одні й ті ж біохімічні процеси можуть бути корисними, якщо їх збудники свідомо використовуються людиною у виробництві тих чи інших продуктів, але й можуть приносити великі втрати, якщо ті процеси виникають спонтанно.

Деякі біохімічні процеси, збудниками яких є мікроорганізми, можуть приносити дуже велику шкоду народному господарству. До таких процесів відноситься, наприклад, псування продуктів в результаті гниття, руйнування деревини та ін.

Нижче розглядаються найбільш важливі біохімічні процеси, збудниками яких є мікроорганізми.

 

Спиртове бродіння

 

Серед всіх біохімічних процесів, пов'язаних з життєдіяльністю мік­роорганізмів, найбільш широке використання в народному госпо­дарстві має спиртове бродіння.

Спиртове бродіння – це процес розкладу цукру на спирт та вуглекислий газ в результаті життєдіяльності мікроорганізмів.

 

С₆Н₁₂О₆ ® 2С₂Н₅ОН+2СО₂+27 ккал

Збудниками спиртового бродіння, як правило, є дріжджі, але деякі представники мукорових грибів і деякі бактерії (Sarcina ventviculi) також можуть бути збудниками цього процесу.

У промисловості використовують тільки дріжджі Sach. ellip­soideus, що належать до сімейства Sacharomycetacea, рід Sacharo­myces. Дріжджі, які спеціально культивують з метою промислового вико­ристання, називають культурними.

Процес спиртового бродіння з давніх часів використовується для отримання вина, пива та інших напоїв. Однак люди, вико­ристо­вуючи цей процес, не знали, що збудниками його є живі організми.

Зв’язок спиртового бродіння з життєдіяльністю дріжджів виявив тільки у середині ХІХ століття визначний французький вчений Луї Пастер.

Дріжджовій клітині притаманний дуже складний комплекс ферментів. Розвиваючись в анаеробному середовищі, дріжджі отри­мують енергію для життєдіяльності за рахунок спиртового бродіння. "Бродіння – це життя без кисню", – писав Луї Пастер, тобто життя за рахунок анаеробних перетворень речовин. Пізніше виявлено, що спирт може утворюватись дріжджами також в присутності кисню повітря, тобто дріжджі відносяться до факультативних анаеробів.

Спиртове бродіння може проходити і без участі живих дріжджо­вих клітин, під впливом клітинного соку дріжджів. Клітинний сік отри­мували шляхом розтирання дріжджів з подрібненим гірським кришталем. Таким чином доведено, що процес спиртового бродіння викликається дріжджами тільки завдяки наявності в їхній клітині органічних каталізаторів – ферментів. Дослідження клітинного соку дріжджів, який отримували не тільки механічним руйнуванням клітин дріжджів, але й пресуванням, а також шляхом мацерації (на­стою­вання з водою висушених дріжджів) показали, що він може вик­ликати спиртове бродіння глюкози, фруктози, мальтози і сахарози. Сік втрачає здатність викликати процес спиртового бродіння при нагріванні його до 50˚ С. Активну основу клітинного соку, тобто фермент, що викликає процес спиртового бродіння, названо зимазою. Потім було виявлено, що зимаза – це не один фермент, а цілий їх комплекс.

Хімізм спиртового бродіння. Вище наведене сумарне рівняння спиртового бродіння. Насправді процес спиртового бродіння відбу­вається за складною схемою, з утворенням цілої низки побічних продуктів цього процесу.

Побічними продуктами спиртового бродіння є оцтова кислота, гліцерин, альдегіди, сивушні масла і деякі інші продукти.

Із вищенаведеного рівняння виходить, що із 1 г цукру можна отримати майже 0,5 г спирту і майже стільки ж вуглекислого газу. Але ще Пастером було доведено, що практичний вихід спирту нижчий, тому що частина цукру втрачається на утворення побічних продуктів (майже 5%) і живлення дріжджів (майже 1%). Залежно від умов, в яких протікає процес спиртового бродіння, відношення окремих продуктів спиртового бродіння може змінюватися.

Біохімічні реакції в процесі спиртового бродіння проходять з участю різних ферментів, які знаходяться в кожній дріжджовій клітині. Умовно цей процес можна поділити на 7 стадій.

1 стадія: фосфорилювання гексоз. Ця стадія іде з участю ферменту фосфоферази, який сприяє перенесенню залишків фосфорної кислоти до гексози. Переносником фосфорної кислоти є аденілові кислоти. Останні вміщують фосфорну кислоту і входять до складу ядерних білків нуклеопротеїдів. Вони завжди є в дріжджових клітинах. Аденілові кислоти є донаторами та акцепторами фосфорних кислот у процесі спиртового бродіння, тобто вони то віддають фосфорну кислоту, то знов її зв’язують. Під час цього вони самі відповідно змінюються, переходячи під час віддачі фосфорної кислоти із аденезин-3-фосфату (АТФ) в аденезин-ди-фосфат (АДФ), а під час зв’язування фосфорної кислоти навпаки – із АДФ в АТФ. Кінцевим продуктом фосфорилювання, незалежно від того, який моносахарид піддається бродінню, є фруктозо-ди-фосфат.

 

 

ОН		СН2ОРО3Н2
|		|
H-C		C-OH
|		|
H-C-OH		OH-C-H
|		|
OH-C-H O	+2H3PO4 фосфофераза	H-C-OH О + 2Н2О
|		|
H-C-OH		H-C
|		|
H-C		CH2OPO3H2
|
CH2OH
Глюкоза		1,6-фруктозо-ди-фосфат

Одночасно АТФ АДФ.

ІІ стадія: розпад 1,6 фруктозодифосфату на 2 тріози. Ця реак­ція відбувається з участю ферменту альдолази. Одна із тріоз є фосфодиоксіацетоном, друга – фосфогліцериновим альдегідом.

 

 

СН2ОРО3Н2		CH2OPO3H2
|		|
C-OH		C=O	Фосфодиоксіацетон
|		|
H-C-OH		CH2OH
|		+
OH-C-H O	альдоза	O
|		//
H-C		C-H	Фосфогліцериновий
|		|	альдегід
CH2OPO3H2		CHOH
		|
		CH2OPO3H2

 

Фосфодиоксіацетону утворюється 95%, фосфогліцеринового альдегіду – 5%. Це співвідношення залишається завжди постійним, тобто рівновага є рухомою. Якщо витрачається одна із тріоз, то її не­стача поповнюється за рахунок ізомеризації іншої тріози. Реакцію ізоме­ризації тріоз каталізує фермент ізомераза.

ІІІ стадія: фосфодиоксіацетон і фосфогліцериновий альдегід вступають у взаємозв’язану окисно-відновну реакцію. При цьому фосфогліцериновий альдегід окиснюється в фосфогліцеринову кислоту, а фосфодиоксіацетон (кетон) відновлюється до гліцери­нофосфату.

Реакція каталізується ферментом козимазою.

 

O	CH2OPO3H2		C-OOH	CH2OPO3H2
//	|		|	|
C-H +	C=H +	H2O козимаза	CHOH +	CHOH
|	|		|	|
CHOH	CH2OH		CH2OPO3H2	CH2OH
|
CH2OPO3H2
Фосфогліце-риновий альдегід	Фосфоди-оксіацетон		Фосфогліце-ринова кислота	Фосфогліце-рин

 

ІV стадія: гліцеринфосфат дефосфорилюється. Під час цього фосфорна кислота поглинається аденозин-ди-фосфатом, який пере­ходить в аденил-3 фосфат, а гліцеринфосфат (фосфогліцерин) пере­ходить в гліцерин.

 

CH2OPO3H2		CH2OH
|		|
CHOH	+ АДФ енолаза	CHOH
|		|
CH2OH		CH2OH
Гліцеринфосфат		Гліцерин

 

Гліцерин є одним із кінцевих продуктів спиртового бродіння, тобто подальших перетворень гліцерин не зазнає.

Гліцерин як побічний продукт бродіння накопичується в не­знач­ній кількості (3% від кількості утвореного спирту). Він утво­рюється тільки на початку спиртового бродіння, доки в середовищі не накопичиться достатньої кількості оцтового альдегіду.

V стадія: фосфогліцеринова кислота перетворюється в пірови­ноградну кислоту, а фосфорна кислота поглинається аденизин­ди­фосфатом, який перетворюється в АТФ.

COOH		COOH
|	енолаза	|
C-HOH	+ АДФ фосфофераза АТФ +	C=O + H2O
|		|
CH2OPO3H2		CH3
Фосфогліцери-нова кислота		Піровиноград-на кислота

VІ стадія: піровиноградна кислота декарбоксилюється і пе­ре­т­во­рюється в оцтовий альдегід та вуглекислий газ. Реакція ката­лізується ферментом декарбоксилазою.

 

 

СООН		О
|		//
C=O	декарбоксилаза	СН3-С-Н + СО2­
|
CH3
Піровиноградна кислота		Оцтовий альдегід

 

Вуглекислий газ, що утворюється під час цієї реакції, є одним із кінцевих продуктів бродіння. За наведеною вище схемою процес спиртового бродіння відбувається тільки на початковому етапі, доки в рідині, що бродить, не накопичиться достатньої кількості оцтового альдегіду. Коли ж з’являється оцтовий альдегід, він витісняє
із взаємозв’язаної окисно-відновної реакції фосфодиоксіацетон
(3 стадія) і стає на його місце. Окисно-відновна реакція відбувається тоді уже не між фосфодиоксіацетоном (кетоном) і фосфоглі­цериновим альдегідом, а між двома альдегідами, тому що між двома альдегідами цей процес проходить легше, ніж між кетоном і альдегідом. Таким чином, замість стадії ІІІ буде відбуватися наступна стадія (стадія VІІ).

VІІ стадія:

 

O
//
C-H	O		COOH
|	//		|
CHOH	+ CH3-C-H + H2O	козимаза	CHOH	+ C2H5OH
|			|
CH2OPO3H2			CH2OPO3H2
Фосфоглі-цериновий альдегід	Оцтовий альдегід		Фосфогліце-ринова кислота	Етиловий спирт

Фосфогліцериновий альдегід окиснюється до фосфогліце­ри­нової кислоти, а оцтовий альдегід відновлюється до кінцевого про­дукту – етилового спирту.

Оскільки фосфодиоксіацетон не бере участі в процесі, гліцерин­фосфат та гліцерин не утворюються, і процес весь час до закінчення бродіння відбувається у бік утворення етилового спирту (стадія 7).

Схематично весь процес спиртового бродіння наведено нижче.

 

Глюкоза + Н3РО4 фосфофераза (АТФ ® АДФ)

1 стадія

1,6 фруктозодифосфат + Н2О

2 стадія

Фосфодиоксіацетон

Фосфогліцериновий альдегід

+Н2О

козимаза

3 стадія

Окиснення

Фосфогліцерин

Фосфогліцеринова кислота

4 стадія

5 стадія

Гліцерин

Піровиноградна кислота

6 стадія

декокарбоксилаза

Оцтовий альдегід + СО2 ↑

7 стадія   козимаза + Н2О

Відновлення до С2Н5ОН

Схема спиртового бродіння.

Гліцеринова форма спиртового бродіння. Із наведеної схеми видно, що гліцерин утворюється тоді, коли в середовищі немає оцтового альдегіду. Таким чином, щоб під час спиртового бродіння накопичити гліцерин, необхідно виключити з реакцій оцтовий альдегід. Це зробити дуже просто. Кислий сірчанокислий натрій (NaHSO3) утворює з оцтовим альдегідом комплексну нерозчинну сполуку. Тому якщо в рідину, що бродить, ввести NaHSO3, то оцтовий альдегід зв’язується і виводиться з реакції. У такому випадку окисно-відновна реакція знову відбуватиметься за рівнянням ІІІ стадії між фосфогліцериновим альдегідом і фосфодиоксіацетоном з утворенням фосфогліцерину і за реакцією ІV стадії – з утворенням гліцерину. У зв’язку з цим замість етилового спирту в результаті бродіння буде накопичуватись гліцерин.

Сумарне рівняння процесу бродіння є таким:

 

О

//

С6Н12О6 С3Н5(ОН)3 + СН3С–Н + СО2

Зв’язаний

NaHSO3

 

Таким чином, на практиці вдається отримати 40% гліцерину (по відношенню до забродженого цукру).

Гліцерин можна отримати також, якщо спиртове бродіння про­во­дити у лужному середовищі. Нормальне спиртове бродіння відбу­вається в кислому середовищі при рН 4–5. При рН 8 відбувається вже не спиртове бродіння, а гліцеринове. Під час цього бродіння оцтовий альдегід із реакції не виводиться, а паралельно відбуваються два окисно-відновні процеси: між фосфородиоксіацетоном і фосфо­гліцериновим альдегідом за реакціями ІІІ і ІV стадій з утворен­ням гліцерину і між двома молекулами оцтового альдегіду з утво­ренням спирту.

 

О О

// //

СН3С–Н + СН3С–Н + Н2О ® СН3СООН + С2Н5ОН

оцтова етиловий кислота спирт

 

У лужному середовищі утворюється менше гліцерину, ніж тоді, коли під час бродіння в рідину вводиться NaHSO₃.

Побічні продукти спиртового бродіння. Оскільки спиртове бродіння відбувається через низку проміжних продуктів, то окрім головних продуктів бродіння – етилового спирту та вуглекислого газу в невеликих кількостях утворюються побічні продукти, а саме: гліцерин, оцтова кислота, оцтовий альдегід, складні ефіри, сивушні масла та ін.

Сивушні масла – це суміш високомолекулярних спиртів, голов­ним чином, бутилових і амилових. Сивушні масла утворюються не із цукру, а в результаті розкладу різних амінокислот, що споживаються дріжджами поряд з цукром як живильні речовини.

Під час виробництва спирту побічні продукти не бажані. Їх усувають шляхом перегонки та ректифікації, яка ґрунтується на різних температурах кипіння спирту і побічних продуктів бродіння. Під час виробництва вина та пива побічні продукти відіграють важливу роль в утворенні букету цих продуктів.

Умови та використання спиртового бродіння. Великий вплив на інтенсивність спиртового бродіння має концентрація цукру в рідині, що бродить. Найкраще проходить спиртове бродіння при кон­цент­­рації цукру 15%. При концентрації цукру 30% дріжджі сповіль­нюють процес спиртового бродіння, а деякі дріжджі зовсім його при­зу­пиняють. Тільки один вид дріжджів Zigosach. Priorianus може викликати спиртове бродіння при значній концентрації цукру – до 80%. Саме цей вид дріжджів є причиною псування меду та варення.

Суттєвий вплив на процес спиртового бродіння має також темпера­тура та реакція середовища. Найсприятливішою темпера­турою для спиртового бродіння є температура 30°С, при температурі 50° С бродіння призупиняється, а при температурі 60–70° С дріжджі гинуть.

Процес спиртового бродіння проходить нормально, якщо реакція рідини, що бродить, кисла. Оптимальне значення величини рН для спиртового бродіння перебуває у межах 4–5.

Збудники спиртового бродіння – дріжджі є факультативними анаеробами, тому процес спиртового бродіння краще проходить, коли відсутній кисень повітря.

Існують два типи спиртового бродіння – верхове і низове. Верхове бродіння проходить дуже швидко. Воно супроводжується сильним виділенням вуглекислого газу і піни. Дріжджі під час верхового бродіння виносяться вуглекислим газом, який виділяється дуже інтенсивно на поверхню рідини, тому бродіння і називається верховим. Таке бродіння застосовується під час виробництва спирту і вина і проходить при температурі, близькій до оптимальної.

Низове бродіння проходить спокійніше і повільніше. Піни утво­рю­ється значно менше, тому дріжджі весь час залишаються на дні посуду. Низове бродіння проходить при температурі суттєво нижчій, ніж оптимальна – близько 10°С. Воно використовується під час пивоваріння.

Дріжджі можуть перетворювати в спирт тільки цукри – моносахариди і дисахариди. Тому під час виробництва спирту із крохмалистої сировини (картоплі, зерна) крохмаль перед бродінням перетво­рюють в цукор (гідролізують). Гідроліз проводять за допо­могою мінеральних кислот або за допомогою солоду (пророслого зерна). В ньому є фермент амілаза, який перетворює крохмаль в цукор.

 

амілаза

(С6Н10О5)n + nН2О ® nC6Н12О6

 

Спирт, що утворюється в результаті бродіння, пригнічує розвиток дріжджів. Більшість дріжджів може доводити вміст спирту в рідині, що бродить, до 12–16%. Вищі концентрації спирту діють згубно на дріжджові клітини і вони гинуть. Тому натуральними називають тільки столові вина, в яких вміст спирту не перевищує 12%. Десертні й міцні вина, в яких вміст спирту перевищує 16%, – це вина спиртовані, тобто вміст спирту в них підвищується додаванням спирту – ректифікату.

Спиртове бродіння використовується також під час виго­товлення хліба. Вуглекислий газ, який утворюється під час спир­тового бродіння, піднімає тісто, розпушує його, і після випікання отри­мують пишний пористий хліб.

Разом з молочнокислим, спиртове бродіння використовують під час виготовлення молочних продуктів: кефіру, кумису, а також під час квашення плодів та овочів.

Спиртове бродіння може приносити і шкоду. Наприклад, свіжі ягоди можуть псуватись в результаті розвитку на них дріжджів. Такі ягоди мають присмак спирту (колючий смак). Потім такі ягоди закисають під впливом оцтовокислих бактерій, що окиснюють спирт до оцтової кислоти.

В результаті спиртового бродіння можуть також псуватися варення та мед.

 

 

Молочнокисле бродіння

Молочнокисле бродіння – це процес перетворення цукру в молочну кислоту в результаті життєдіяльності молочнокислих бактерій.

Молочнокисле бродіння використовувалось людьми з давніх часів, однак природа цього бродіння була з’ясована відносно недавно.

Луї Пастер в 1857 р. довів, що молочнокисле бродіння викли­кається мікроорганізмами, але виділити збудників цього бродіння у вигляді чистих культур йому не вдалося. Чиста культура збудників молочнокислого бродіння була виділена тільки в 1878 р. і вивчена більш детально у 1894 – 1895 рр.

На сьогодні відомо багато різних бактерій, які ферментують цукор з утворенням молочної кислоти. При цьому деякі з них перетворюють цукор тільки в молочну кислоту, інші, поряд з молочною кислотою, утворюють побічні продукти (оцтову, янтарну кислоти, етиловий спирт, вуглекислий газ, водень та інші продукти).

Якщо в процесі молочнокислого бродіння із цукру утворюється тільки молочна кислота, то такий процес називається типовим (гомоферментативним) молочнокислим бродінням. Якщо ж при бродінні поряд з молочною кислотою утворюються інші продукти, то такий процес називається нетиповим (гетероферментативним) молочнокислим бродінням.

Хімізм молочнокислого бродіння. Процес типового молоч­нокислого бродіння можна виразити таким сумарним рівнянням:

 

С₆Н₁₂О₆ ® 2СН₃СНОНСООН,

а нетипового:

 

СН2СООН

2С6Н12О6 ® СН3СНОНСООН+СН3СООН+ | +С2Н5ОН+СО2+Н2

СН2СООН

 

Це тільки загальні рівняння, а насправді процес відбувається за дуже складною схемою, через низку проміжних продуктів.

До моменту утворення піровиноградної кислоти процес проходить за такою ж схемою, як і спиртове бродіння. Далі, у зв’язку з відсутністю у молочнокислих бактерій ферменту карбоксилази (піро­ват­де­кар­боксилази), реакція декарбоксилювання пірови­ноград­ної кис­лоти не відбувається. Натомість, завдяки ферменту лактико­дегі­дрогенази, що притаманний молочнокислим бактеріям, піровино­градна кислота вступає в окисно-відновну реакцію з фосфо­гліцериновим альдегідом. При цьому в результаті відновлення піро­ви­ноградної кислоти утворюється молочна кислота, а в результаті окис­нення фосфогліцеринового альдегіду – фосфогліцеринова:

 

Лактикоде-

O

гідрогеназа

//

+ Н2О

CH3COCOОH+ C-H

CH3CHOHCOOH+

COOH

|

|

CHOH

CHOH

|

|

CH2OPO3H2

CH2OPO3H2

Піровино-градна кислота

Фосфоглі-цериновий альдегід

Молочна кислота

Фосфоглі-церинова кислота

 

Процес гетероферментативного молочнокислого бродіння відбу­вається за значно складнішою схемою.