А. Химический синтез из АК, но около 8 дней.
Б. Более совершенным - синтез человеческого инсулина - технологии рекомбинантной ДНК.
Ген инсулина из 11 хромосомы клеток человека вшивают в ДНК определенных м/о. Эти м/о синтезируют и выделяют в среду человеческий инсулин.
В. Биосинтез инсулина.
Синтез полипептида инициируется на рибосомах с образованием N-концевого “сигнального” пептида длиной в 23 аминокислотных остатка, который проникает через мембрану эндоплазматического ретикулума (ЭПР).
2. Дальнейшее удлинение направляет полипептидную цепь внутрь цистерн ЭПР, имея конечным результатом образование препроинсулина (109 аминокислотных остатков).
3. “Сигнальный” пептид отщепляется специфическими протеазами и образующийся проинсулин (86 АК) транспортируется из ЭПР в аппарат Гольджи. Там под действием двух специфических пептидаз от него отщепляется связующий пептид (31 АК), или С-пептид. В итоге образуется двухцепочечная молекула инсулина.
4. Инсулин и С-пептид хранятся в секреторных гранулах, образуемых из мембран аппарата Гольджи.
Депонирование инсулина в β-клетках поджелудочной железы происходит с образованием гексамеров и других кристаллических форм, для образования которых необходим цинк.
5. Секреторные гранулы высвобождаются в кровеносное русло путем экзоцитоза.
В секреторных гранулах инсулин и С-пептид находятся в эквимолярных количествах и высвобождаются в кровь одновременно. Определение уровня С-пептида в плазме крови используется для контроля за функцией бета-клеток и продукции ими инсулина.
Весь процесс биосинтеза занимает около 1 часа. Общие запасы инсулина оцениваются в 200-250 ЕД.
Секреция инсулина стимулируется повышением уровня глюкозы выше порогового уровня 5,55 мМ/л.
Секреция инсулина ингибируется при голодании и/или стрессе. Этот эффект первично обусловлен ингибирующим действием адреналина.
Механизм действия Инсулин связывается со специфическим рецептором, обнаруженным на поверхности большинства клеток млекопитающих. Рецептор инсулина – это гликопротеин, состоящий их четырех субъединиц (2α и 2β), которые удерживаются между собой дисульфидными связями. β-субъединица пересекает мембрану, а α-субъединица выступает снаружи клетки и обеспечивает связывание гормона. Цитозольный домен каждой β-субъединицы обладает тирозинкиназной активностью, то есть катализирует фосфорилированиетирозиновых остатков белков.Связывание инсулина с α-субъединицами рецептора индуцирует конформационные изменения, которые передаются к β-субъединицам, вызывая быстрое аутофосфорилирование тирозинового остатка каждой β-субъединицы. Это повышает способность тирозинкиназной активности рецептора фосфорилировать другие белки, обозначенные как IRS – субстраты инсулинового рецептора. Фосфорилированные IRS способствуют изменению активности других киназ, которые в свою очередь фосфорилируют специфические белки (ферменты), что и ведет к развитию метаболических эффектов инсулина.
Среди посредников действия инсулина в клетке лучше всего охарактеризованы белки IRS-1 и IRS-2.
IRS-2 активирует ряд протеинкиназ и липидкиназ, что приводит к развитию метаболических эффектов инсулина посредством влияния: а) на количество мембранных глюкозных транспортеров (GLUT-4) и инсулиновых рецепторов; б) на активность ряда ключевых ферментов обмена жиров, белков и углеводов через их фосфорилирование или дефосфорилирование; в) на транскрипцию некоторых генов ферментов обмена углеводов и жиров.
IRS-1 через многоступенчатую активацию МАР-киназы и последующую активацию фактора транскрипции elk-1 стимулирует транскрипцию генов, необходимых для роста и деления клеток. Другими словами, активация IRS-1 приводит к развитию ростовых эффектов инсулина (синтез ДНК, РНК, рост и размножение клеток).
Каскадная активация МАР-киназы:
а) IRS-1 активирует гуаниннуклеотид-связывающий белок Ras;
б) Ras-белок активирует фермент Raf-1 (серин-треониноваяпротеинкиназа);
в) Raf-1 активирует (через фосфорилирование) киназу МАР-киназы, а она в свою очередь через фосфорилирование активирует МАР-киназу;
г) активная МАР-киназа продолжает каскадное фосфорилирование, вовлекая в него ядерные факторы транскрипции (белки, необходимые для роста и деления клетки).
Быстрые метаболические эффекты инсулина определяются циклом “фосфорилирование-дефосфорилирование” белков и ферментов.
В одном случае инсулин снижает концентрацию внутриклеточного ц-АМФ, активируя фосфодиэстеразу или ингибируя активность мембранной аденилатциклазы. Это ведет к уменьшению активности ц-АМФ-зависимойпротеинкиназы, что позволяет ферменту гликогенсинтазе оставаться в активной форме, в то же время фермент киназафосфорилазы, отвечающий за распад гликогена, ингибируется.
В другом случае, действие инсулина не зависит от концентрации ц-АМФ и связано с активированием фосфатаз. Это, например, повышает активность гликогенсинтазы.
Мембранные эффекты инсулина В клетки глюкоза поступает путем облегченной диффузии, связанной с наличием в мембранах клеток особых белков-переносчиков, называемых глюкозными транспортерами - GLUT 1– GLUT 5. Переносчик GLUT 4 обуславливает вход глюкозы в скелетные мышцы, миокард и жировую ткань. Транспорт глюкозы в эти ткани резко повышается в присутствии инсулина. Данный эффект связан с перемещением GLUT-4 из внутриклеточных везикул на поверхность клеток, а значит с увеличением числа функционирующих переносчиков глюкозы. Эти ткани относятся к абсолютно инсулинозависимым.
В некоторые ткани и клетки, включая нервную ткань, эритроциты, эндотелий сосудов, хрусталик и сетчатку глаза, эпителий кишечника и почечные канальцы, транспорт глюкозы не зависит от концентрации инсулина. Это связано с тем, что на поверхности их клеток находятся глюкозные транспортеры, активность которых не зависит от концентрации инсулина. Эти ткани относятся к инсулинонезависимым.
Печень представляет собой важное исключение из этой схемы. Инсулин не стимулирует облегченную диффузию глюкозы в гепатоциты, но усиливает её приток косвенным путем, повышая количество глюкокиназы – фермента, превращающего глюкозу в глюкозо-6-фосфат. В результате фосфорилирования концентрация свободной глюкозы поддерживается на низком уровне, что способствует поступлению глюкозы в клетки путём простой диффузии по градиенту концентрации.
Регуляция рецепторов инсулина Связывание инсулина обуславливает проникновение комплекса инсулин-рецептор в клетку путем эндоцитоза. Внутри клетки инсулин распадается в лизосомах, а рецептор либо разрушается, либо возвращается на поверхность клетки. Высокий уровень инсулина способствует деградации рецепторов, таким образом, уменьшая число рецепторов на поверхности клетки..
