План
А Программа
1. Ультраструктура бактериальных клеток.
2. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама.
3. Сложные методы окраски (методы Шеффера—Фулто-на, Ожешко, Циля—Нильсена, Бурри—Гинса, Нейс-сера).
А Демонстрация
1. Мазок из смеси бактерий (окраска по методу Грама).
2. Капсула бактерий (окраска по методу Бурри—Гинса).
3. Кислотоустойчивые бактерии Mycobacterium tuberculosis в мокроте (окраска по методу Циля—Нильсена).
4. Спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).
5. Зерна волютина в клетках Corynebacterium diphtheriae (окраска по методу Нейссера).
А Задание студентам
1. Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в готовом препарате из смеси бактерий (окраска по методу Грама). Зарисовать.
2. Самостоятельно приготовить мазки из смеси бактерий, окрасить по методу Грама, микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.
3. Микроскопировать и зарисовать:
• капсулы (окраска по методу Бурри—Гинса);
• С.diphtheriae, содержащие зерна волютина (окраска по методу Нейссера);
• кислотоустойчивые бактерии М.tuberculosis (окраска по методу Циля—Нильсена);
• спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).
4. Сделать заключение по результатам проведенных ис
следований.
А Методические указания
Сложные методы окраски. Сложные методы окраски используют для выявления ультраструктурных компонентов бактериальных клеток, имеющих достаточно большие размеры (макрокапсулы, жгутики, цитоплазматические включения и т.д.), а также для дифференцировки (различения) бактерий в зависимости от химического состава и особенностей их тонкой организации (ультраструктуры).
Окраска по методу Грама
1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снять, а краситель слить.
2. Нанести раствор Люголя на 1—2 мин.
3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30—60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Промыть водой.
5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1—2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцвечивание — удаление комплекса генцианового фиолетового с
йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс ген-цианового фиолетового с йодом.
Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спиртом. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.
Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробиологии. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грам-отрицательным — гонококки, менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимости от возраста культуры, особенностей культивирования и других факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.
Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Грама, заключается в "переобесцвечивании" мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.
