Тема 2. 2. Изучение морфологии и ультраструктуры бактериальных клеток. Сложные методы окраски

План

А Программа

1. Ультраструктура бактериальных клеток.

2. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама.

3. Сложные методы окраски (методы Шеффера—Фулто-на, Ожешко, Циля—Нильсена, Бурри—Гинса, Нейс-сера).

А Демонстрация

1. Мазок из смеси бактерий (окраска по методу Грама).

2. Капсула бактерий (окраска по методу Бурри—Гинса).

3. Кислотоустойчивые бактерии Mycobacterium tuberculosis в мокроте (окраска по методу Циля—Нильсена).

 

4. Спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеф­фера—Фултона).

5. Зерна волютина в клетках Corynebacterium diphtheriae (окраска по методу Нейссера).

А Задание студентам

1. Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в го­товом препарате из смеси бактерий (окраска по методу Грама). Зарисовать.

2. Самостоятельно приготовить мазки из смеси бакте­рий, окрасить по методу Грама, микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.

3. Микроскопировать и зарисовать:

 

• капсулы (окраска по методу Бурри—Гинса);

• С.diphtheriae, содержащие зерна волютина (окраска по методу Нейссера);

• кислотоустойчивые бактерии М.tuberculosis (окраска по методу Циля—Нильсена);

• спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).

4. Сделать заключение по результатам проведенных ис­
следований.

А Методические указания

Сложные методы окраски. Сложные методы окраски исполь­зуют для выявления ультраструктурных компонентов бактери­альных клеток, имеющих достаточно большие размеры (мак­рокапсулы, жгутики, цитоплазматические включения и т.д.), а также для дифференцировки (различения) бактерий в зависи­мости от химического состава и особенностей их тонкой орга­низации (ультраструктуры).

Окраска по методу Грама

1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильт­ровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снять, а краситель слить.

2. Нанести раствор Люголя на 1—2 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30—60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой.

5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1—2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фио­летовый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцве­чивание — удаление комплекса генцианового фиолетового с

 

йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс ген-цианового фиолетового с йодом.

Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спир­том. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.

Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробио­логии. К грамположительным бактериям относятся стафило­кокки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грам-отрицательным — гонококки, менингококки, кишечная палоч­ка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимос­ти от возраста культуры, особенностей культивирования и дру­гих факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Гра­ма, заключается в "переобесцвечивании" мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утра­чивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фук­сином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.