Введение. Бактерии относятся к доминиону Bacteria. Они являются одноклеточными прокариотическими (доядерными) организмами. Бактериальная клетка обладает характерными
особенностями строения (ультраструктуры) и существенно отличается от эукариотической.
Бактерии имеют микроскопические размеры, большинство — в пределах разрешающей способности светооптической микроскопии (превышают 0,2 мкм), однако существуют и более мелкие формы.
Форма клетки относится к числу важных таксономических признаков бактерии. По форме клеток бактерии подразделяют на шаровидные, палочковидные, нитевидные и извитые (рис. 2.1).
Шаровидные бактерии — кокки (coccus — зерно) имеют правильную сферическую или эллипсоидную форму. Кокки могут образовывать характерные скопления, что обусловлено особенностями их деления и способностью дочерних клеток сохранять связь друг с другом после деления. Кокки могут располагаться беспорядочно (микрококки), парами (диплококки), в виде цепочек из 3 и более кокков (стрептококки), в виде пакетов, состоящих из 4 (тетракокки) и 8 (сарцины) кокков, и в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь (стафилококки).
Диплококки и стрептококки образуются при делении в одной плоскости, если дочерние клетки могут не отходить друг от друга. Упорядоченное деление в 2 и 3 плоскостях приводит к образованию тетракокков и сарцин. При делении в разных плоскостях образуются стафилококки.
Палочковидные бактерии (бациллы) различаются по размерам, форме клеток и их концов, а также по расположению. Они могут быть тонкими, утолщенными на концах либо с обрубленными концами. Одни располагаются в виде одиночных клеток, другие парами — диплобактерии, третьи в виде цепочек — стрептобактерии.
Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палочками, имеющими V4- У2 завитка (вибрионы) или несколько (1—3) завитков (спириллы), и спиралевидными бактериями (спирохеты). Нитевидные и ветвистые формы характерны для актиномицетов.
Бактерии не имеют дифференцированного ядра. Нуклеоид бактерий — аналог ядра — не окружен мембраной и располагается в цитоплазме. Бактерии лишены внутриклеточных мембран и ограниченных ими органелл. Плазматическая мембрана (ПМ) является единственной мембраной, присущей всем бактериальным клеткам. В цитоплазме бактерий свободно располагаются рибосомы, могут также присутствовать включения и споры (рис. 2.2). Последние могут располагаться терминально, субтерминально и центрально. Снаружи от ПМ находится клеточная стенка (КС). По строению КС бактерии подразделяют на 2 группы: фирмикутные и грациликутные. КС может быть покрыта капсулой или капсулоподобной оболоч-
|
Рис.2.1. Формы бактерий. Рис.2.2. Споры бактерий,
а — шаровидные; б — палочковид- а — терминальное расположение; б —
ные; в — извитые. субтерминальное; в — центральное.
кой. Многие бактерии имеют внешние органеллы движения — жгутики (рис. 2.3). Реснички (фимбрии, пили), располагающиеся на поверхности клетки, участвуют в прикреплении бактерий к различным субстратам (адгезии) и друг к другу (коге-зии).
Для изучения морфологии и ультраструктуры бактерий применяют световую и электронную микроскопию.
Морфологию бактерий обычно изучают методом световой микроскопии фиксированных окрашенных препаратов. Для окрашивания бактерий применяют различные красители. Чаще
|
всего используют анилиновые
красители (метиленовый си
ний, генциановый фиолето
вый, малахитовый зеленый,
фуксин и др.). В основе ок
раски лежат сложные хими
ческие и физико-химические
реакции между красителем и
химическими соединениями в
составе бактериальной клетки.
При этом различные струк
турные компоненты клетки
могут окрашиваться разными
красителями. Цитоплазма
(особенно в фиксированных
мазках) обладает сродством к
Рис.2.3. Жгутиковые бактерии. основным красителям (мети-
а — монотрих; б - лофотрих; в - леновый СИНИЙ, кристалли-
амфитрих; г — перитрих. ческий фиолетовый, везувин
и др.). Для выявления различных структур бактериальной клетки применяют нейтральные и кислые красители.
Различают простые и сложные методы окраски. Простые методы заключаются в окраске препарата одним красителем и позволяют изучать форму и размеры бактерий. Сложные методы (по Граму, Цилю—Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Тинкториальные свойства — способность воспринимать и удерживать красители — зависят от особенностей строения и химического состава бактериальной клетки. Сложные методы окраски позволяют дифференцировать бактерии по этим признакам и имеют диагностическое значение. Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактерий: жгутиков, капсул и разных цитоплазматичес-ких включений.
Методы темнопольной и фазово-контрастной микроскопии дают возможность прижизненного изучения бактерий, в частности их подвижности. Для этого готовят нативные (прижизненные) препараты.
Электронную микроскопию используют для изучения ультраструктуры (тонкой организации) бактерий.
Тема 2.1. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ И ИХ ТИНКТОРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ
▲ План
▲ Программа
1. Морфология бактерий и методы ее изучения.
2. Подвижность бактерий и методы ее изучения.
3. Простые методы окраски препаратов.
4. Определение размеров бактерий.
а Демонстрация
1. Приготовление мазков из бактериальных культур.
2. Красители, используемые в микробиологии.
3. Подвижность бактерий в препарате "висячая" капля.
▲ Задание студентам
1. Микроскопировать и зарисовать готовые мазки, окрашенные простым методом (стафилококки, стрептококки, сарцины, палочки, стрептобациллы).
2. Приготовить мазки из бактерий, выращенных на жидкой и плотной питательных средах.
3. Окрасить мазки простым методом.
4. Микроскопировать и дифференцировать бактерии в
мазках по основным морфологическим признакам и зарисовать их. 5. Определить размеры бактериальной клетки.
Методические указания
Приготовление препаратов для микроскопического исследования. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях используют препаровальные иглы.
Петлю прокаливают в пламени горелки для уничтожения посторонних бактерий. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением захватывают материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают край пробирки и закрывают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой.
Приготовление нативньгх препаратов для прижизненного изучения микроорганизмов. Метод "висячей" капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю исследуемого материала. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют объектив малого увеличения (8х или 10х), находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х или иммерсионный и исследуют препарат. Определяют подвижность бактерий.
Метод "раздавленной" к а п л и. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла.
Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001 % раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат "висячая" или "раздавленная" капля и микроскопируют.
После микроскопии препараты "раздавленной" или "висячей" капли опускают в дезинфицирующий раствор.
Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят суспензию (взвесь) бактерий. Если мазок готовят из
жидкой питательной среды, то материал непосредственно наносят петлей на предметное стекло и распределяют его так, чтобы получить тонкий мазок. В других случаях первоначально на предметное стекло наносят каплю, воды, или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и готовят взвесь. При правильном распределении материала в мазке при микроскопии видны изолированные бактериальные клетки. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать.
Фиксация препарата. Высушенные мазки подвергают термической или химической обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло проводят несколько раз через пламя горелки (мазком вверх).
Мазки крови, мазки-отпечатки из органов фиксируют погружением на 5—20 мин в метиловый или этиловый спирт или другие фиксирующие жидкости.
Окраска препаратов простым методом. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.
Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии. Для люминесцентной микроскопии на предметных стеклах готовят фиксированные препараты-мазки или на-тивные препараты, которые окрашивают специальными флюоресцентными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.
Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электронов. Исследуемый объект максимально очищают от посторонних примесей и наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую сеточку. Для контрастирования применяют соединения тяжелых металлов (золото, осмий, рутений и др.).
Измерение микробных клеток. Измерение микробов осуществляют в ходе микроскопического исследования с помощью специальных приспособлений. Для измерения применяют окуляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр служит для непосредственного измерения объекта и представляет собой стеклянную пластинку в окуляре, в центральной части которой нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр представляет собой стекло, в середине которого имеется эталонная шкала, разделенная на 100 частей. Цена деления шкалы
известна и указана на стекле. Обычно каждое деление шкалы объект-микрометра равно 10 мкм.
Микроорганизмы измеряют окуляр-микрометром, предварительно определив цену его делений с помощью объект-микрометра. Для этого объект-микрометр устанавливают на предметном столике микроскопа и, вращая винтами для перемещения столика, добиваются, чтобы одно из его делений совпало с каким-либо делением окуляр-микрометра. Затем отмечают число делений объект-микрометра, в которые полностью укладывается число делений окуляр-микрометра. Зная величину деления объект-микрометра (10 мкм), устанавливают величину деления окуляр-микрометра. После этого объект-микрометр заменяют исследуемым препаратом и определяют размеры бактериальной клетки линейкой окуляр-микрометра при той же степени увеличения, при которой была измерена величина его делений.
Для измерения микроскопических объектов используют следующие метрические единицы: 1 микрометр (мкм) = Ю-3 мм, 1 нанометр (нм) = 10~° мм.
Результаты изучения бактериальной культуры протоколируют, как показано в табл. 2.1.1.
Таблица 2.1.1. Характеристика культуры по морфологическим и тинк-ториальным признакам (форма протокола)
| Форма | Размеры | Окраска по методу Грама | Наличие | Кислото- устоичи- вость | Под- | ||
| клеток | спор | капсул | зерен волю-тина | вижность | |||
