Принципи колонкової хроматографії

Прийоми роботи з іонообмінними колонками, методи гель-| | чмьтраціі і т. д. будуть детально обговорюватися в гол. 4 і 5. 11 брухт короткому вступі дано лише основні принципи і-описано обладнання, що використовується в колонкової хроматографії.

Хроматографія заснована на тому, що розчинені вещест-II відстають від фронту розчинника у міру його просування? пі носія. Назва «хроматографія» (від грец. Chroma - колір і grapho - пишу) було вперше використано для опису КИЯ розділення природних пігментів в результаті різного ступеня їх затримки на аркуші фільтрувального паперу (рис. II.6). 1тот принцип досі широко використовується і може бути-І i тан одномірної хроматографією, так як аркуш паперу прак-ня не має товщини. Другий вимір з'являється при; використанні колонки з носієм, що може бути прирівняне до стопці з багатьох смужок паперу, як показано на 1.6, В. Тепер зразок на старті являє собою диск п MI піліндр, а не тонку лінію. У міру проходження розширювача по колонці речовини, що містяться у зразку, рас-Вределяются наступним чином. Речовини, повністю извле-кие розчинником, рухаються разом з фронтом розчинність, (Rf = \) і дуже швидко вимиваються. Речовини, повністю, чфованние носієм (Rf = 0), залишаться на старті. \ Роматографія можлива тільки в тому випадку (0 <i? / <L), ii речовина затримується в результаті часткової адсорбції | Н) п кінцевому рахунку елюіруется. Два речовини з дуже in константами утримування (Rf) можуть бути розділі-остю тільки при використанні досить довгою

колонки і при наявності не занадто великий поздовжньої дифузії. Розділова здатність частково залежить від числа, ефективних адсорбційних стадій, з яких складається весь процес поділу.

 

 

Рис. 1.6. Принципи хроматографії. А. Зразок, нанесений в центр гуртка фільтрувального паперу, при додаванні буферного розчину розтікається в радіальному напрямку і компоненти зразка розділяються у вигляді кілець відповідно до значень їх Rf. Б. Одновимірна паперова хроматографія дає поділ компонентів зразка на смуги. В. Введення ще одного виміру, що реалізується в колонкової хроматографії.

 

Внаслідок того що нанесений шар зразка має певну товщину, число стадій поділу, зване числом теоретичних тарілок, залежить від співвідношення довжини колонки до товщини шару зразка, а також від зернистості адсорбенту і • швидкості дифузії. Так як будь-який зразок, обсяг якого не перевищує певної величини, в результаті дифузії розподіляється приблизно в одному і тому ж обсязі, дуже важливо правильно визначати ширину елюіруемой фракції. Вона залежить як від початкової товщини шару зразка, так і від ступеня дифузії по мерс проходження зразка по колонці. Як ми побачимо далі (гл. 4), при колонкової хроматографії зазвичай проводиться зміна буферних систем, здійснювана або східчасто, або з використанням градієнту. У цих умовах концепція числа тарілок мало придатна.

Колонкової хроматографії-це головний метод поділу ферментів, що дозволяє використовувати величезну різноманітність адсорбентів. Деякі адсорбенти мають дуже великий ємністю щодо тих чи інших білків (> 100мгХ ХСМ ~ 3), тоді як у інших адсорбентів ємність може бути в 200 разів менше зазначеної. Тому розміри колонок, необ-дімих для поділу, варіюють в широких межах. Теорія-^ тічсскі для ідеальної системи форма колонки не має значення, так як відношення довжини колонки до товщини шару зразка залишається незмінним, якщо обсяги адсорбенту і зразка не змінюються (рис. 1.7). Однак розмір часток дуже важливий; більш тонке поділ білків досягається при «проходженні» ними більшого числа частинок адсорбенту, що відповідає більшій кількості теоретичних тарілок. Таким чином, при даному розмірі часток адсорбенту довша колонка має певні переваги. З іншого боку, у колонці великого діаметра можна використовувати більш дрібні ча-i м | ці, так як зменшення швидкості протікання через кожен квадратний сантиметр, зазвичай неминучий для таких щільних II сорбентів, компенсується великим поперечним перерізом

юнки. На практиці, однак, вважають за краще використовувати більш i шіпие колонки, оскільки ідеальні умови роботи не зі-б подаються, а потік не є достатньо рівномірним (див. рис. 5.8 і 5.9). Це призводить до збільшення тривалістю ■ in процесу, що може бути небажаним. У лабораторії

1ЖНИ бути колонки різної ємності (від 1 см3 до 2 л) і раз-

i форми (від коротких, в яких діаметр приблизно i> мні нисоте, до довгих, в яких діаметр становить близько

Про їм соти), і всім їм знаходиться застосування.

 

Рис. 1.8. Схема типового аплікатора для колонкової хроматографії.

Найкращі колонки обладнані спеціальними пристроями для вирівнювання верхньої та нижньої поверхонь носія, так що рівномірний потік рідини, що протікає вниз по колонці, не порушується на її кінцях. Ефективна пориста сітка або диск на дні колонки дають можливість розчину вільно витікати в збірне простір, яке повинно мати мінімальний обсяг, так як це зменшує змішування фракцій. Для цієї ж мети під час нанесення зразка і подальшої елюції буферні розчини слід дуже рівно розподіляти по поверхні носія (рис. 11.8).

У навчальній лабораторії, де працюють десятки студентів, з економічних міркувань неможливо забезпечити кожного з них такий колонкою. При роботі з малими обсягами можна використовувати такі прості і дешеві системи, як пастерівська піпетка з тампоном зі скляної вати в місці звуження трубки (рис. 1.9, Л), шприц з поршнем або без нього, що має на дні перфорований пластиковий диск (рис. 11.9, 5), або проста скляна трубка з гумовою пробкою, вставленої в один з її кінців, і будь-якою фільтром типу пористого диска або шару фільтрувальної тканини, що забезпечує рівномірний збір елюату (рис. 1.9, В). Нерівномірний струм рідини на поверхні носія може бути причиною її нерівномірного протікання через колонку. Невеликий шар рідини над адсорбентом дозволяє усунути всі ці порушення, якщо адсорбент представляє собою добре ущільнюється матеріал і його поверхня не пошкоджується при переміщенні над нею буфера; кілька прикладів нерівномірного протікання рідини через колонку показано на рис. 1.10. Так як більшість білкових розчинів безбарвні, часто не звертають уваги на тс, що колонка працює погано.

Ще однією причиною порушення хроматографічного процесу може бути нерівномірна набивка колонки. Адсорбент фактично завжди складається з часток різних розмірів, це значить, що при спокійному осадженні більші частки виявляться на дні, тоді як верхня частина колонки в основному буде заповнена найдрібнішими частинками. Цей факт сам па собі не має особливого значення, якщо не торкатися питання про відтворюваності. З іншого боку, взмучіваніе розчину під час осадження може привести до нерівномірного розподілу часток і, отже, буде причиною нерівномірного набивання колонки, що спричинить за собою нерівномірне протікання розчину під час роботи.

 

Рис. 1.9. Найпростіші колонки: пастерівська піпетка (Л), шприц (Б) і скляна трубка (В). Всі вони пристосовані для колонкової хроматографії.

Рис. 1.10. Деякі складнощі, пов'язані з нанесенням зразка на колонку. А. Ідеальна ситуація: рідина рівномірно розподіляється по поверхні. 5. Через невеликий щілини на бічній поверхні пористого аплікатора більша частина рідини проходить через цю щілину, що призводить до не-р; ішомерному розподілу зразка на поверхні адсорбенту. В. Рас-твор, що випливає по краплях з трубчастого аплікатора, вибиває в адсор-Бенте ямку, що призводить до надмірного струму рідини в центрі колонки. '1тоби уникнути ситуації, зображеної на рис. В, над поверхнею ад-еорбента створюють великий шар буфера. Д. Частинки, що містяться в образ-иг, закупорюють поверхню адсорбенту. У разі утворення невеликий піки на одній стороні поверхні адсорбенту весь потік рідини може приходити через неї і адсорбція буде нерівномірною. Щоб не допустити п.нп, зразок слід отцентріфугіровать або профільтрувати перед нане-ІММ І! колонку.

 

В ідеальному випадку колонку слід заповнювати адсорбентом за один прийом при постійному перемішуванні суспензії, як показано на рис. 1.11. Короткі колонки зручно заповнювати густий суспензією, в якій на 1 обсяг адсорбенту припадає не більше 1 обсягу буфера. При цьому частинки швидко осідають завдяки тому, що рідина вільно витікає з колонки через відкриту вихідну трубку. Після набивання колонки необхідно пропустити через неї кілька обсягів буфера для врівноваження; це особливо важливо при роботі з іонооб-менник; в цьому випадку рН суспензії адсорбенту в буфері повинен бути доведений до потрібної величини ще перед набиванням колонки.

Протікання рідини через колонку може здійснюватися під дією сили тяжіння; якщо тиск водяного стовпа висотою близько 1, м не дає достатньо швидкого потоку, отже, система, ймовірно, частково блокована або використовуються трубки занадто тонкі і створюють великий опір. Широко застосовуються перистальтичні насоси, за допомогою яких можна підтримувати постійну швидкість протікання буфера, дозволяють розміщувати зразок, буфер і градієнтний змішувач на зручному рівні.

Поділ білків. Відбувається на колонці, і результати записуються в міру того, як рідина витікає з колонки. На рис. 1.12 зображені також реєструючий УФ-спектрофотометр, що вимірює оптичну щільність при довжині хвилі 280 їм (смуга. Поглинання Trp + туг) або при довжинах хвиль від 220 до 205 нм (смуга поглинання

пептидних груп),, що забезпечує більшу чутливість, і колектор фракцій, що збирає рівні об'єми рідини за певні проміжки часу. Якщо працювати без перистальтичного насоса, швидкість потоку може змінюватися; в цьому випадку для отримання фракцій рівного об'єму більш прийнятний рахунок крапель. З іншого боку, величина крапель змінюється внаслідок зміни поверхневого натягу в міру елюції білків. Потік з колонки можна розділити, з тим щоб відбирати невелика кількість злюата на ферментативний аналіз. При правильній синхронізації можна записувати результати визначення ферментативної активності паралельно з кривою елюції білка. Градієнтну елюції можна здійснювати за допомогою двох склянок, з'єднаних сифоном. Більш точні й відтворювані градієнти виходять при використанні

Рис. 1.11. Ідеальний метод заповнення колонки. Суспензія безперервно перемішується в резервуарі, розташованому над колонкою, з тим щоб частки різних розмірів рівномірно розподілялися по всій довжині колонки

I 12. Схема розташування всієї системи для колоночной хроматогра-ФМН | | почія автоматичний збір елюату за допомогою колектора фракцій I Mi ц | "ривное вимір ферментативної активності.

Загальні методичні питання

Для початківця дослідника гель-фільтрація відкриває значно менше можливостей, ніж іонообмінна хроматографія. До певної межі використовуваний буфер не повинен впливати на досягається ступінь дозволу і єдина важлива змінна - це тип матеріалу, тобто інтервал ефективного фракціонування, для якого призначений цей матеріал. Припустимо, що в розпорядженні дослідника є два-три поперечно-зшитих декстранова або агарози-них гелю (сефакріл, ультрагель), з якими легко працювати, і відразу ж виникає питання - який гель вибрати і які повинні бути розміри колонки. Зразок наноситься в невеликому обсязі, оскільки обсяг кожного білкового компонента буде збільшуватися через обговорювалися вище ефектів, пов'язаних з дифузією і неідеальної потоку. Так як ефективний обсяг фракціонування становить приблизно половину обсягу колонки, чіткість поділу обумовлена ​​тим, що зразок наноситься в малому обсязі, який не повинен перевищувати 3% загального обсягу колонки. Якщо обсяг ще менше (аж до 1% загального обсягу колонки), то поділ виходить дещо краще. При обсягах нижче 1% дифузія і яеідеальность потоку викликають майже однакове розмивання піка незалежно від об'єму зразка (рис. 5.6).

 

 

Рис. 5.6. Вплив обсягу зразка на профіль елюції з гель-фільтрувальної колонки [29]. Незважаючи на те що теоретичний нульової обсяг відповідає піку I, внаслідок дифузії пік білка розмивається до обсягу, близького до П. У разі III обсяг зразка більше ідеального, в результаті чого загальний обсяг елюції збільшується. У разі IV обсяг зразка занадто великий і поділ молекул можливо, тільки якщо їх розміри різняться не менш ніж у чотири рази.

Рис. 5.7. Ідеальне поділ п'яти білків на гель-фільтрувальної колонці [29]. Кожен з цих білків за масою відрізняється від наступного за ним білка в два рази. На колонку нанесено однакову кількість кожного білка. Висота піків знижується через більшу дифузії більш дрібних молекул.

 

При елюції 90% кожного компонента зазвичай виходить в обсязі, що становить 8-10% загального обсягу колонки, причому розмивання піків залежить певною мірою від положення піку елюції. Перші фракції, що містять найбільші молекули, швидше проходять через колонку і тому в меншій мірі схильні ефектів турбулентності. Отже, розмивання піка буде тим менше, ніж раніше виходить фракція. Крім того, молекули менших розмірів мають більш високий коефіцієнт дифузії, що призводить до додаткового розмивання. Ідеалізований профіль елюції, що відображає цю ситуацію, зображений на рис. 5.7. Якщо молекули потрібного ферменту мають невеликі розміри, то його пік буде більшою мірою розмиватися при елюції і з більшою ймовірністю буде загр-язнен білками подібних розмірів. Якщо ж фермент елюіруется спочатку, то пік буде гостріше, але при наявності великої кількості високомолекулярних домішкових білків цілком імовірно, що вони будуть перекриватися з фракцією ферменту (рис. 5.8). Таким чином, інтервал фракціонування слід вибирати, беручи до уваги як розміри основних забруднюючих молекул, так і величину молекули виділяється ферменту.

Важливе значення мають розміри колонки, в тому числі її загальний обсяг, а також співвідношення довжини та діаметру. В ідеальних умовах останній параметр не мав би грати істотної ролі. Дійсно, товста і коротка колонка має ту перевагу, що вона дозволяє досягти

 

великих швидкостей потоку і зменшити його турбулентність, що призводить до меншого розмивання піків (див. рис. 1.7). З іншого боку, дозвіл у такий колонки може бути нижчою, оскільки число гранул, а отже, і число елементарних актів гель-фільтрації, що відбуваються в міру того, як білки входять до частки гелю і виходять з них, у розрахунку на кожну молекулу, буде менше. Але головний недолік короткою і товстої колонки полягає в тому, що у ній важко добитися рівномірного нанесення зразка і рівномірного потоку буфера. Навіть якщо зона кожного компонента, яка за формою повинна являти собою правильний диск, спотворюється лише в малому ступені, це призводить до поганого дозволу (рис. 5.9). У довгій і тонкої колонці білкові зони менш схильні до спотворень в горизонтальній площині, в усякому разі такі спотворення тут не настільки важливі, так як зразок займає більшу відстань по висоті колонки (рис. 5.9). У повсякденній практиці гель-хроматографію проводять в колонках, довжина яких у 20-40 разів перевищує їх діаметр. Нерівномірне нанесення зразка, спотворення хроматографіче-ського шару у стінок колонки в результаті поверхневого натягу й інші причини, що призводять до нерівномірності потоку, в таких колонках виявляються менш суттєвими, ніж в> коротких і товстих колонках того ж об'єму.

Рис. 5.8. Відділення одного білка (заштрихований) від інших на гель-фільтрувальної колонці з використанням матеріалів різної пористості. А. Великопористий матеріал - фермент елюіруется пізніше і добре відділяється від білків А і В, але не від білка D. Б. дрібнопористий матеріал-фермент елюіруется районі вільного об'єму і перекривається з білком В; добре відділяється від білка D.

 

Рис. 5.9. Порівняння гель-фільтрації в товстій і короткою колонці з гель-фільтрацією у довгій колонці. При ідеальному потоці (А і В) повинні виходити однакові результати. Незначні відхилення потоку в короткій колонці (5) призводять до поганого дозволу, але істотно невліяют на результати у довгій колонці (Г).

 

.

Рис. 5.12. Схема, що демонструє, яким чином можна уникнути гравітаційної нестійкості, що на рис. 5.5. А. Щільний розчин про-• зразка наносять знизу колонки при висхідному потоці рідини. Б. Після того як весь зразок завдано, колонку перевертають. В. Менш щільний Йуфер слід за зразком - колонка промивається низхідним потоком.

 

 

Нижче підсумовані практичні рекомендації. Розміри "колонки повинні в 30-100 разів перевищувати обсяг зразка. Вихідна концентрація білка в ідеалі повинна становити 10 - '20 мг-мл" 1, найбільше - 30 мг-мл "1. Таким чином, 100 мг білка слід розчинити в обсязі не меншому ніж 3,5 мл, краще 5-6 мл, і використовувати колонку об'ємом 200-250 см3. Довжина колонки повинна в 20-40 разів перевищувати її діаметр, тобто для вказаної кількості білка підходящими будуть колонки діаметром 2,5 і довжиною 50 см або відповідно 1,8 і 100 см. Ідеальні розміри колонки можна визначити наступним чином: діаметр = ут/10 см, де т - кількість білка в мг, а довжина = 30Хдіаметр.

Швидкості потоку обмежуються максимально досяжними швидкостями протікання буфера. Сучасні жорсткі мате-

ріали витримують швидкість потоку, що перевищує швидкість встановлення рівноваги, тому необхідно знати рекомендації фірм-виробників. Для сефакрілов придатні швидкості потоку до 30 см-ч "1 (30 мл-ч ^-см" 2), але для ультрагелей рекомендуються менші швидкості (див. також гл. 7). Час поділу можна обчислити, знаючи розміри колонки. Якщо фермент виходить в середині інтервалу фракціонування для сефакрілов, то в наведеному вище прикладі з колонкою діаметром 2,5 і довжиною 50 см він буде з'являтися в елюатів приблизно через 2 години після нанесення (при швидкості потоку 30 см-ч ^ 1). Для колонки розміром 1,8 x100 см часом буде в два рази більше, хоча на довгій колонці дозвіл може бути декілька вище. Як вже зазначалося, більш жорсткі матеріали з дрібними гранулами дозволяють швидше розділяти речовини під тиском, і цілком імовірно, що методи із застосуванням помірного тиску (проміжні між рутинними операціями, проведеними при низькому тиску, і швидкими операціями під високим тиском з використанням техніки ЖХВД) отримають більш широке поширення.

УДК 547.963,4.

 

Л..А.. Тиунов, д-р мед. наук, Б. Ф. Сухомлинов, д-р биол. наук М. Б. Гончар, канд. хим. наук, В. К. Бородавко, канд. мед. наук, Е. П. Дудок, канд. биол. наук, В. М. Лукьянец, канд. хим.. наук