Невелику кількість гемоглобіну переводили в ціанметформу для визначення концентрації. Концентрацію гемоглобіну визначали за методикою Кушаковського [11].
Обладнання, матеріали і реактиви.
1. Спектрофотометр, кювети, пробірки, штатив, піпетки.
2. Розчин оксигемоглобіну.
3. Дистильована вода.
4. 10 %-ний розчин K3Fe(CN)6.
5. 10 %-ний розчин ацетонціангідрину.
Хід роботи.
У пробірку вносять 0,1 мл розчину гемоглобіну, додають 4,8 мл води і 0,05 мл 10 %-ного розчину K3Fe(CN)6.. Спостерігається зміна забарвлення розчину від червоного до коричневого, що свідчить про перехід оксигемоглобіну у метгемоглобін. Через 5 хв. додають 0,05 мл 10 %-ного розчину ацетонціангідрину. Розчин стає яскраво червоним. Метгемоглобін мерейшов у ціанметгемоглобін, для якого характерна широка смуга у видимій ділянці спектру поглинання з максимумом при 540 нм. Використовуючи мілімолярний коефіцієнт поглинання при цій довжині хвилі вираховують концентрацію гемоглобіну за формулою:
Смкмоль = (D540 / · d) · n = (D540 / 11,51· d) · n - з розрахунку на мономер.
Смг/мл = [(D540 · 60 000 / (11,51 × 4) · d ]· n - розрахунок на тетрамер,
звідси - Смг/мл = D540 · 1,47 · n, де
D540 - оптична густина розчину гемоглобіну;
ε – мілімолярний коефіцієнт поглинання ціанметгемоглобіну при 540 нм (11,51 млмоль-1 см-1);
1,47 – коефіцієнт перерахунку молекулярної маси гемоглобіну (тетрамер) на мілімолярний коефіцієнт поглинання;
d – товщина шару розчину у кюветі дорівнює 1 см;
n - розведення.
Визначення пероксидазної активності метгемоглобіну.
Гемоглобін, як і міоглобін, проявляє пероксидазну активність. Важливим є те, що гемоглобіни окремих видів організмів і навіть окремі фракції одного і того ж білка можуть проявляти неодинакову пероксидазну активність. Цей феномен може бути використаним як у наукових дослідженнях так і в медичній практиці.
Хід роботи.
Для роботи використовують гемоглобін, виділений за методом Драбкіна [ ].
Розчин оксигемоглобіну (HbО2) переводять у метформу (MetHb). До 1 мл розчину HbО2 (100 мкг/мл) додають 0,01 мл 10 %-ного розчину K3Fe(CN)6 .
Реактиви та реакційні суміші готують за схемою, описаною для визначення пероксидазної активності меміоглобіну.
1. Реакційну суміш для визначення пероксидазної активності метгемоглобіну готують за схемою:
MetHb Vмл + (2-V) мл Н2О + 2 мл буфера + 0,5 мл гваякола
(0,5 MetHb Mb + 0,5 мл Н2О + 1 мл буфера + 0,25 мл гваякол)
2. Суміш переносять в спектрофотометричну кювету.
3. Як контроль використовують таку ж суміш. Однак, замість гідроген пероксиду вносять ту ж кількість води.
4. В дослідну пробу вносять 0,5 (0,25) мл гідроген пероксиду, швидко перемішують, закривають кювету і проводять спектрофотометрування зразка. Початок реакції відраховують з часу введення Н2О2. Спостерігається утворення забарвленого комплексу, кількість якого зростає, пов’язаної з розщепленням Н2О2, вивільненням.
5. За ходом реакції спострерігають по зміні поглинання світла при 440 нм за допомогою спектрофотометра СФ-46 або ФЕК.
Величину Т (пропускання), або Д (поглинання) проводять через кожні 30 с.
Краще перевести значення Т в значення Д (поглинання): Д = 2 – lg Т.
6. Пероксидазну активність визначають за формулою:
А = ΔD· V · 1000/ε · a· c,
де: А – пероксидазна активність MetHb;
ΔD – середнє значення вимірювання оптичної густини проби при довжині хвилі 440 нм;
V - загальний об’єм суміші у кюветі;
1000 – коефіцієнт перерахунку від мікромоля до наномоля;
ε - коефіцієнт мілімолярної екстинкції (6,22 ·см-1мкм-1);
a – об’єм зразка у кюветі;
c – концентрація гемоглобіну (зразка).
7. Будують кінетичну криву, як функцію Д = f(t) і знаходять початкову швидкість пероксидазної реакції по тангенсу кута прямолінійної кривої в одиницях оптичної густини (швидкість реакції виражають в мкМ/с, використовуючи множинник 11,23, одержаний калібруванням за допомогою окисної системи Ag+ -S2O82--).
Висновки. Звіт.
Література?
