Практичні поради про фракціонування білків шляхом висолювання

Практична частина

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ МІОГЛОБІНУ.

Міоглобін це гемопротеїн мономерної природи, що містить 153 амінокислотних залишки, молекулярна маса 17600. Головне призначення цього білка – депонування кисню в червоних м’язах. Маючи велику спорідненість до кисню, міоглобін може створювати запаси кисню і потім, при його дефіциті, при певних ситуаціях, в м’язах, що працюють, віддавати цей кисень цитохромоксидазі мітохондрій. B останній час встановлено, що міоглобін є здатний не тільки депонувати кисень, але й забезпечувати полегшену дифузію останього в компартаменти клітини, компенсувати флуктації концентрації кисню в середовиші, підтримувати градієнт кисню поблизу мітохондрій, що функціонують. Bстановлено, також, що метміоглобін, який утворюється під впливом ендогенних метаболітів, здатний проявляти пероксидазну активність – розщеплювати перекис водню, а також пероксадативно окислювати НАДН. Таким чином, міоглобін сприяє оптимізації функції газотранспортних систем організму і є одним з необхідних елементів, що забеспечуюють гомеостаз червоного м’яза.

Розчинність. За розчинностю Мb перевершує багато глобулярних білків. Досліджуючи розчинність Мb, який виділили з сердечного м'язу коня, Теорел показав, що Мb може знаходитись в розчинному стані у фосфатному буфері рН 6,6 навіть при 3 М концентрації солі. В той же час розчинність Нb в цих умовах значно нижча.

Властивість Мb добре розчинятись у водних середовищах лежить в основі його виділення з м'язевих клітин і очищення від інших сполук, яким властива менша розчинність, шляхом фракційного висолювання різними агентами. Ця ж властивість Мb використовується і при визначенні деріватів в сечі.

Виявлені міжвидові відмінності в розчинності Мb. Здатність Мb добре розчинятись має велике фізіологічне значення. Дійсно, в червоних м'язах, які виконують напружену фізичну роботу і в м'язах водних тварин, здатних припиняти зовнішнє дихання на певний період, концентрація Мb сягає значної величини. Наприклад, в м'язах кашалота вона може складати 37,1 г%, але ні осадження, ні кристалізація в м'язах навіть при такій високій концентрації не спостерігається. Таким чином, висока розчинність Мb – одна з унікальних фізико-хімічних властивостей, що забезпечує цьому гемопротеїну можливість підтримувати кисневий гомеостаз шляхом депонування кисню за рахунок високої концентрації в м'язі.

Незвичайно висока розчинність Мb в клітині визначається його структурною морфологією. На поверхні білкової глобули розміщується велика кількість ліофільних бокових груп амінокислотних залишків, що дозволяють зв'язувати 82 молекули розчинника, які забезпечують формування сольватованої оболонки, що рівномірно покриває поверхню молекули.

На цих унікальних властивостях міоглобіну базуються методи його виділення, очистки і фракціонування.

Виділення міоглобіну з скелетного м’яза.

Практичні поради про фракціонування білків шляхом висолювання.

Принцип методу. Висолювання білків пов'язане з розчиненням солей у розчині, що містить білки. Варто розглянути деякі особливості цього процесу. Дуже важлива природа солі. Крім її ефективності в сенсі осадження білків необхідно враховувати такі фізичні характеристики солі, як розчинність. Найбільш ефективні солі – це ті солі, аніони яких мають великий заряд (наприклад, сульфат, фосфат і цитрат). Катіони в цьому відношенні порівняно менш важливі. За здатністю до висолювання аніони розташовуються в ряд Гофмейстера, який для деяких звичайних аніонів виглядає наступним чином: SCN^-, J^-, СlO₄^-, N0з^-, Вг^-, С1^-, СН₃СОО^-, SО₄^2-, РО₄^3-. Хоча, судячи по положенню в цьому ряді, фосфат більш ефективний, ніж сульфат, на практиці при нейтральному значенні рН фосфат складається з суміші іонів НР0₄^2- і Н₂Р0₄^-,які менш ефективні, ніж РО₄^3-. Що стосується ефективності дії катіонів на осадження білків, то моновалентні іони можна розташувати в наступний ряд: NH₄ ⁺ >K⁺ >Na⁺. Зі звичайних недорогих солей ефективними для осадження білків є сульфати, фосфати і цитрати натрію, калію і амонію.

Важливе значення має густина концентрованого розчину, оскільки ефективність центрифугування при відділенні осаду визначається різницею між густиною білкового осадку і щільністю розчинника.

Солі калію в більшості своїй не підкоряються загальним правилам розчинності, хоча фосфати калію можна цілком використовувати. Цитрат натрію дуже добре розчинний, але рідко дає певні переваги при осадженні білків, за винятком того, що його можна використовувати при рН вище 8. Що ж стосується солей амонію, то з ними неможливо працювати при високих значеннях рН внаслідок їх буферної дії. Тільки одна сіль володіє всіма перевагами і не має недоліків при роботі з типовим білком - це сульфат амонію. Винятком є ті випадки, коли потрібно працювати при високих значеннях рН. Розчинність сульфату амонію дуже мало змінюється в діапазоні температур від 0 до 30 ° С; концентрація насиченого розчину у воді становить приблизно 4М. Густина цього насиченого розчину дорівнює 1,235 г ∙ см^-3, а густина білкового агрегату в такому розчині – 1,29 г ∙ см^-3. Розчин 3 М фосфату калію при рН 7,4 має густину 1,33 г ∙ см^-3. Так як білковий осад у цьому розчині володіє такою ж густиною, його неможливо відокремити центрифугуванням. Однак, відділення осаду можна здійснити за допомогою фільтрації або ж шляхом адсорбції на амфіфільних носіях, наприклад агарозі. Осадження білків -3-4 М сульфатом амонію іноді також може бути утрудненим через надлишкову густину, створену присутністю в грубих екстрактах інших солей і компонентів.

Перед осадженням білків солями амонію необхідно додати в розчин будь-які металозв’язуючі агенти, наприклад ЕДТА. Кількість сульфату амонію, яке потрібно додати для отримання необхідної концентрації, можна підрахувати за допомогою простої формули (рівняння 3.5а). Отже, кількість сульфату амонію в грамах, яку потрібно додати до 1 л розчину при 20 ° С, щоб з розчину з молярністю М1 отримати розчин з молярною М2, дорівнює:

Кількість (г) = 533 (М₂ – М₁)/ 4,05 – 0,3 М₂ _. (рівняння 3.5а)

Ця формула враховує збільшення об’єму при додаванні солі. Так, хоча розчинність сульфату амонію становить 533 г/л при 20 °С, для отримання насиченого розчину до 1 л потрібно додати 761 г солі. Об’єм такого розчину дорівнюватиме 1,425 л, а його густина складе:

1761/1425 = 1,235 г/см³. Концентрацію сульфату амонію зазвичай виражають у відсотках насичення, допускаючи, що розчин еквівалентний воді за здатністю розчиняти сульфат амонію. Для цього використовують рівняння (3.5б).

Кількість сульфату амонію в грамах, яке потрібно додати до 1 л розчину при 20 ° С, щоб з розчину з насиченням S₁ % отримати розчин з насиченням S₂%, дорівнює:

Кількість (г) = 533(S₂ – S₁) / 100 – 0,3 S₂. (3.5б)

Обидві ці формули базуються на припущенні, що розчин 100%-ного насичення відповідає 4,05 М розчину. Варто зазначити, що на практиці через присутність у розчині інших солей і білка справжня розчинність сульфату амонію у дослідній пробі буде трохи менше, ніж 533 г/л при 20 ° С. Кількість необхідного сульфату амонію можна знайти у додатку А в таблиці I, (можна таблицю помістити у тексті) де вона подана з інтервалом в 5%. Значення для інших ступенів насичення можна отримати виходячи з цих цифр шляхом інтерполяції. Значення рН може бути важливим при осадженні, проте в більшості випадків при незначній зміні рН від експерименту до експерименту різниця виявляється несуттєвою. Найкраще працювати при нейтральних значеннях рН (6 - 7,5). Сульфат амонію слабко підкислює розчин, тому рекомендується використовувати буфер (наприклад, фосфатний) приблизно 50 мМ концентрації для стабілізації рН.

Загальні зауваження. Фракціонування сульфатом амонію має одну важливу перевагу в порівнянні практично з усіма іншими методами – воно призводить до стабілізації білків. Суспензія білкового осаду „пасти” або кристалів в 2-3 М розчині стабільні протягом багатьох років.

Перед додаванням твердого сульфату амонію необхідно розбивати всі грудки і повільно додавати сіль до розчину при перемішуванні. Першу порцію можна розчинити досить швидко, але в міру наближення до заданого проценту насичення останні порції солі необхідно додавати повільніше. Розчинене повітря може виходити з розчину і викликати утворення піни, але це не суттєво впливає на білки, проте якщо ціноутворення відбувається в результаті занадто енергійного перемішування, то поверхневий натяг, що діє на білки, що потрапили в пухирці, може призвести до їх денатурації. Після розчинення останньої порції солі перемішування необхідно продовжувати протягом 10-30 хв. до досягнення повної рівноваги між розчиненими і агрегованими білками; потім розчин центрифугують. Зазвичай достатньо центрифугувати при 10³ g / хв. (наприклад, при 10 000 g протягом 10 хв або при 3000 g протягом 30 хв.). При високих концентраціях солі може знадобитися триваліше центрифугування. Надосадову рідину зливають, вимірюють її об’єм і підраховують кількість солі, необхідну для наступного фракціонування. Осад розчиняють в потрібному буфері. Слід зазначити, що кількість буферу не повинна перевищувати кількість осаду більш ніж в 1-2 рази, так як цього достатньо, щоб концентрації солі виявилася значно нижче точки преципітації білків, присутніх в розчині. Якщо весь осад не розчиняється, то нерозчинний матеріал це, ймовірно, денатурований білок, який необхідно відділити фільтруванням або центрифугуванням. Висока концентрація солі запобігає також протеоліз і дію бактерій. Білкові розчини найкраще зберігати в найбільш концентрованому вигляді. Це підвищує стабільність білків, і, крім того, завжди легше потім розвести розчин, ніж сконцентрувати його.

Замість розчинення твердої солі в зразку в нього можна додавати потрібну кількість. Насиченого розчину так само, як це робиться при додаванні органічних розчинників (розд. 3.4). Такий прийом особливо корисний, якщо фермент повністю осідає при 50%-ному насиченні, тому що при цьому об’єм зростає тільки в два рази. При роботі з великими об’ємами додавання сульфату амонію у вигляді розчину неприйнятно, але для виділення білків в малих кількостях це цілком підходящий метод.

При більш високому відсотку насичення об'єм розчину збільшується ще більше, а розведення білка при цьому в свою чергу вимагає ще більш високого ступеня насичення, щоб осадження було настільки ж ефективним. Тому даний метод не рекомендується використовувати при ступені насичення вище 50%.

Корисно зразок залишити на ніч. Після того як вирішено використовувати фракціонування з допомогою сульфату амонію, необхідно визначити, яким повинен бути відсоток насичення для одержання фракції необхідного білка.

Методи виділення міоглобіна із скелетних м’язів засновані на здатності сірчанокислого амонію осаджувати супутні білки водорозчинної фракції білків м’язів. Метод цей має назву дрібного висолювання.

Обладнання: м’язи, м’ясорубка, скляна паличка, паперовий фільтр, марля.

Реактиви: 1. Дистильована вода.

2. Їдкий натрій (NaOH, 20%-ний розчин)

3. Сірчанокислий амоній ((NH₄)₂SO₄).

Щоб уникнути артефактів в подальших дослідженнях, слід приміняти високоочищений сірчанокислий амоній (кваліфікації “хч” або “осч”). Якщо реактиву високого ступеня чистоти немає, то необхідно провести перекристалізацію з реактивів кваліфікації “ч” або “чда” за наступною методикою:

600г сірчанокислого амонію розчинити в 500 мл бідистильованої води, нагріти до 80°С, додати декілька мг перекристилізованого ЕДТА. Відфільтрувати через складчатий фільтр, розлити в стакани по 100 мл і додати в кожний по 50 мл абсолютного етолу. Довести рН до 7,0 розчином аміаку. Залишити на холоді для кристалізації; кристали, що випали, промити охолодженим етанолом. Висушування проводити на повітрі. Одержаний препарат є безводним.

Хід роботи:

1. Замороженні м’язи, очищені від жиру та сполучної тканини, пропускають через м’ясорубку. Одержаний фарш заливають 2-х кратним об’ємом дистильованої води (краще на 100 г фаршу 150 г води) та залишають для екстракції на ніч в холодильнику, запобігаючи заморожуванню розчину.

2. Після 10-12-ти годинної екстракції грубі частинки подріблених м’язів відділяють від екстракту, проціджуючи суміш крізь подвійний шар марлі. Вимірюють об’єм фільтрату. До одержаного розчину додають сірчанокислий амоній до 50%-го насичення. Можна також проводити екстракцію безпосередньо в 50%-му розчині сірчанокислого амонію, доведеного безпосередньо розчином NaOH (20%) до величини рН 7,0.

3. При висолюванні супутних білків з м’язевого екстракту сірчанокислий амоній слід додають невеликими порціями, поволі розмішуючи до повного розчиненнясолі. Не допускати утворення піни, оскільки часто міоглобін денатурує на поверхні розділу двох фаз. Після доведення насичення сульфатом амонію до 50%, рН доводять до 7,0 шляхом додавання невеликої кількості 20% розчину NaOH. Щоб запобігти локальній денатурації білку в точці додавання NaOH слід обережно додавати їдкий натрій одночасно перемішуючи розчин скляною паличкою.

4. 50%-ний розчин залишають в холодильнику на 30 хв. Потім проводять фільтрування через паперовий складчатий фільтр. Вимірюють об’єм фільтрату.

5. До фільтрату знову додають сірчанокислий амоній з розрахунку насичення до 80%, враховуючи остаточний об’єм, користуючись формулами 3.5.а, 3.5.б і таблицею розчинності сірчанокислого амонію (табл. Х). Знову доводять рН до 7,0, як описано вище. Через годину відфільтровують осад крізь паперовий фільтр. На фільтрі залишається білки, які осіли при 80 %-ному насиченні екстракту сульфатом амонію. Знову вимірюють об’єм фільтрату.

6. До одержаного фільтрату додають сірчанокислий амоній з розрахунку 100%-ного насичення (табл. Х). і залишають на холоді.

7. Через декілька годин осад відфільтровують крізь паперовий фільтр. “Пасту”, що осідає на фільтрі, збирають в посуд, що щільно закривається і виготовленний з хімічно інетного матеріалу. Пасту зберігати про 0-4°С.

Мілімолярний коефіцієнт міоглобіну складає 10,76 при 505 нм, молекулярна маса 17000. Для більш швидкого виділення міоглобіну можна вести висолювання після 80%-го насичення (75%-го для щурів), додаючи невеликі порції солі, при появі осаду проводити фільтрування.

Одержану осаджену білкову фракцію для продовження досліджень необхідно піддати очистці від солі. Для цього осад розчиняють. Знову розчинений осад містить значні кількості сульфату амонію, який необхідно видалити перед наступною стадією очищення. Для цього зазвичай використовують такі методи, як діаліз або хроматографічні методи очистки та розділення. Найбільш використовуваний метод на першому етапі це: гель-фільтрація на «знесолюючих» колонках (розд. 3.4. гель-фільтрація)

У багатьох випадках після фракціонування сульфатом амонію використовують більш складні методи (наприклад, іонообмінну хроматографію (розд. 4.3) або афінну адсорбційну хроматографію (розд. 4.5)