Для очистки препаратів міоглобіну від сірчанокислого амонію і від низьмолекулярних розчинних сполук, що є супутним в процесі виділення міоглобіну з м’язової тканини, застосовують методи гель-фільтрації.
Принцип методу. В основі методу гель-фільтрації (гель-хроматографії) лежить здатність декстринових гелів пропускати молекули великого розміру і затримувати молекули менших розмірів. В колонці з декстриновим гелем, що набух, розрізняють два види об’ємів води: зовнішня вода V0 – об’єм, зайнятий водою, що оточує гранули гелю та внутрішній об’єм - V1, що дорівнює сумі води, захопленої гранулами сефадексу у процесі набухання. Коефіцієнт розподілу розчиненої речовини між внутрішньою та зовнішньою водою позначають Кр. Речовини з Кр = 0 не проникають у гранули сефадексу. Речовини, Кр яких знаходиться в межах 0 та 1 частково проникають в пори гранул геля, а речовини з Кр більше 1 частково адсорбуються матрицею гелю. У ході гель-фільтрації найбільшу швидкість руху у колонці мають компоненти розчину, розміри молекул яких є більшими, ніж розмір пор у гелі. Отже, високомолекулярні компоненти суміші „обганяють” низькомолекулярні, що зазнають часткової адсорбції. Такі компоненти не проникають у гранули гелевої фази і виходять з колонки першими. Дрібніші молекули, які здатні проникати всередину гелю, безперервно обмінюються між рідкими фазами всередині та назовні гелю і рухаються по колонці значно повільніше. Найдрібніші частинки розчину (наприклад, неорганічні солі) виходять з колонки останніми. На такому принципі ґрунтуються методи фракціонування білків та інших органічних полімерів, їхнє знесолювання, визначення молекулярної маси, заміна одних буферних розчинів іншими тощо. Як зазначалося вище, гель-хроматографія широко застосовується для фракціонування, очистки та визначення фізико-хімічних констант макромолекул.
Обладнання: хроматографічна колонка (співвідношення довжини до діаметра колонки складає 1:10), штатив з пробірками або колектор відбору фракцій, спектрофотометр, центрифуга лабораторна, склянка, лійка, скляна палочка, медичний шприц, піпетки.
Реактиви: 1. Сефадекс G-25.
2. Бідистильована вода.
3. Ферріціанід калію (K3Fe(CN)6.).
4. Хлорид барію (ВаCl2).
5. Реактиви для визначення концентрації білків.
Хід роботи.
1. Підготовка хроматографічної колонки для роботи. Колонка – це скляна трубка, діаметром 10 – 15 мм, висотою 25 см, звуженої у нижній частині. Розмір колонки може коливатися залежно від мети роботи та способу розділення. В основу колонки впаюють пористу скляну пластинку або перфорований диск (рис. 3.5.2, 1) (рис. 3.5.2, 2). Комерційні колонки (рис. 3.5.2, 3) мають спеціальні додаткові пристрої – кінцевики-адаптери змінної довжини, які дають змогу регулювати довжину колонки та попереджають процес перемішування фракцій елюату.
А
2. Підготовка сефадексу. Гранули сефадексу легко набухають у воді, утворюючи гель, який використовують для розділення речовин залежно від молекулярної маси. Сухий сефадекс ресуспендують у 200-кратному об’ємі води і залишають на 48 год за кімнатної температури для повного набухання. Процес набухання можна пришвидшити, якщо проводити його на киплячій водяній бані протягом 5 год.
Діаметр частинок сефадексу G-25 (середній) дорівнює 50 – 150 мкм. Об’єм набухлого гелю в мл/г сухого гелю дорівнює 4 – 6 мл.
Сефадекс G-25 (середній) врівноважують в бідистильованій воді в хроматографічній колонці, що має охолодження.
Колонку (розміром 1,5´50 см; для аналітичного розділення рекомендоване співвідношення довжини до діаметра колонки – 10:1 або 20:1; під час знесолення використовують коротші та ширші колонки) готують так, як описано нижче.
3. Заповнення колонки сефадексом. Заповнення колонки має надзвичайно важливе значення для успішного розділення досліджуваних речовин. Колонку закріплюють строго вертикально, закривають нижній кран (затискач) (рис. 3.32, 4) і наливають у неї приблизно на 1/3 її об’єму дистильовану воду. Енергійними рухами скляного поршня (рис. 3.32, 8) вивільняють простір під диском від бульбашок повітря. На диск за допомогою поршня поміщають кружечок фільтрувального паперу, який за розмірами має точно відповідати внутрішньому діаметру колонки. Поршень обережно виймають, стежачи щоб у колонку не потрапили пухирці повітря.
У підготовлену колонку через лійку або по паличці вносять порівняно густу суспензію повністю набухлого гелю. Суміш гелю ретельно перемішують, так щоб рідина стікала по стінці і не захоплювала з собою пухирці повітря. Починають заповнювати колонку при закритому крані. Суспензії дають час для осідання, тоді частково відкривають кран і постійно у лійку добавляють суспензію сефадексу – так забезпечують безперервне осідання часточок сефадексу в колонці та попереджують надмірне ущільнення сорбенту. Необхідно стежити, щоб наповнення колонки було рівномірним.
Щоб уникнути утворення пухирців повітря в шарі гелю на колонці, суспензію сефадексу перед заповненням колонки можна деаерувати за допомогою водоструменевої помпи в колбі Бунзена або вносити його в колонку, підігрівши до температури, яка повинна перевищувати кімнатну (50–60°С). Сефадексу в колонці дають час відстоятися, тоді для врівноваження та досягнення сталої висоти стовпця гелю колонку промивають трьома – п’ятьма об’ємами води (або буферного розчину).
Після заповнення колонки до потрібної висоти закривають нижній кран (затискач) і дають суспензії осісти, не допускаючи „висихання” наповнювача в колонці (для цього над верхнім шаром сорбенту в колонці завжди повинен бути шар розчинника). Ще однією вимогою є те, щоб верхній шар наповнювача мав максимально гладеньку горизонтальну поверхню.
А 
Б
Рис. 3.5.2.1. Колонки для хроматографії на декстринових гелях.
А
Рис. 3.32. Хроматографічні колонки спрощеного (а) та ускладненого (б) варіантів:
1 – скляна колонка; 2 – перфорований диск; 3 – корок із скляною трубкою; 4, 7 – крани-затискачі; 5, 9 – верхні резервуари; 6 – буферний розчин над гелем; 8 – скляний поршень; 10 – адаптери; 11 – сітки з нейлону; 12 – капілярний шланг, з’єднаний із реєструвальним устаткуванням і (або) колектором фракцій; 13 – сорбент Б
Рис.3 
.
Рис. 3.5.2.2. Ідеальний метод заповнення колонки.
А - суспензія безперервно перемішується у резервуарі, що забезпечує рівномірний розподіл частинок по усій довжині колонки.
4. Підготовка зразка для внесення в колонку. Об’єм матеріалу, що підлягає очищенню не повинен перевищувати 1/5 об’єму сефадексу в колонці.
Невелику кількість „пасти” міоглобіну, одержану після висолювання, розчиняють у невеликій кількості бідистильованої води. Розчин повинен бути прозорим. Якщо розчин каламутний то його необхідно профільтрувати. Для одержання однієї лігандної форми - метміоглобіну, перед гельфільтрацією до розчину додають невелику кількість K3Fe(CN)6. Одержаний матеріал вносять у колонку.
5. Внесення зразка в колонку. Підготовлену кількість зразка вносять у колонку. Внесення зразка можна виконувати кількома способами. Найпростіший із них полягає в такому:
• рідину з поверхні наповнювача обережно забирають, залишаючи шар на 1–2 мм;
• за допомогою піпетки обережно вносять зразок і, відкривши нижній кран, дають йому змогу увійти в шар сорбенту;
• залишки зразка на стінках колонки над сорбентом змивають за допомогою невеликої кількості елюенту;
• після того як він повністю увійде в наповнювач, додають нові порції елюювального розчину, створюючи шар товщиною 5–10 см.
Рис. 3.5.2.3. Нанесення зразка на поверхню геля гель-фільтруючої колонки вручну. Необхідно дотримуватися обережності, щоб не порушити рівну поверхню гелю. А. Бідистильованій воді (чи буферу) дають повністю вбратися в гель, після чого закривають кран. Б. Зразок наносять на гель за допомогою піпетки; відкривають кран. В. Дають зразкові проникнути в гель. Г. Зразок повністю вбрався в гель; закривають кран. Д. Наносять воду (чи буфер) і відкривають кран. Є. Дають воді (буферу) повністю вбратися в гель і закривають кран. Ж. Наносять ще певний об’єм води (буферу) і приєднують до колонки аплікатор; мертвий простір у верхній частині колонки допустимий.
Увага! Для зменшення перемішування верхнього шару під час внесення в колонку зразка над ним інколи розміщують кружечок фільтрувального паперу.
| Конусоподібна поверхня, яка полегшує рівномірний поділ буфера на поверхні адсорбента Нейлонова сітка Невеликий”мертвий” простір Адсорбент |
Рис. 3.2.2.4. Схема типового аплікатора для колонкової хроматографії.
Найкращі колонки оснащені спеціальним пристосуванням для вирівнювання верхньої і нижньої поверхні носія, так що рівномірний потік розчину вниз через колонку не порушується по всій висоті.
6. Гель-фільтрація на колонці. Після внесення зразка колонку приєднують до верхнього резервуара, визначають швидкість протікання елюювального розчину і починають збирати фракції за допомогою колектора, або вручну використовуючи штатив з пробірками. Елюцію проводять за допомогою бідистиляту, швидкість елюції 1 - 3 мл/хв.
Рис. Простий колектор відбору фракцій
Рис. Три типи пристроїв для створення градієнту елюції
Рис. 3.5.2.4. Схема устаткування для хроматографії на колонках:
1 – пристрій для створення лінійного градієнта (а – ємність із розчином високої концентрації; б – ємність–змішувач; в – магнітна мішалка); 2 – перистальтична помпа; 3 – колонка; 4 – УФ–детектор’; 5 – фракції зразка
Найбільшу швидкість руху на колонці мають компоненти розчину, розміри молекул яких є більшими, ніж розмір пор у гелі. Такі компоненти не проникають у гранули гелевої фази і виходять з колонки першими. Дрібніші молекули, які здатні проникати всередину гелю, безперервно обмінюються між рідкими фазами всередині та назовні гелю і рухаються по колонці значно повільніше. Найдрібніші частинки розчину (наприклад, неорганічні солі) виходять з колонки останніми (див. рис 3.16). На такому принципі ґрунтуються методи фракціонування білків та інших органічних полімерів, їхнє знесолювання, визначення молекулярної маси, заміна одних буферних розчинів іншими тощо.
7. Побудова графіку елюції. Вихід елюату з колонки контролюють спектрофотометрично при 505 нм, або при 631 нм (характеристичні максимуми для MetMb). За отриманими результатами будують графік елюції метміоглобіну. На горизонтальній осі якого відкладають номери пробірок (фракцій) або об’єм рідини, яка пройшла через колонку, а на вертикальній – значення оптичної густини фракцій (див. рис. 3.16).
Вставити графік елюції
Рис. 3.5.2.5.
Ступінь очистки від сірчанокислого амонію (обессолювання) контролювали якісною реакцією на іони SO42- концентрованим розчином хлориду барію. Якщо колонка на якій проводиться обессолювання калібрована стандартними білками з відомими молекулярними масами, то можна відразу ж провести визначення молекулярної маси досліджуваного міоглобіну, враховуючи, що елюційний об’єм білка є лінійною функцією десяткового логарифму його маси.
Концентрацію міоглобіну у кожній фракції (пробірці) можна визначити спектрофотометрично, використовуючи коефіцієнт мілімолярної екстинкції (ε) при 505 нм.
