Робота 3. Серологічна діагностика. Визначення титру антитіл у сироватці хворого (розгорнута реакція аглютинації).
Принцип методу. Утворення конгломератів, антиген-антитіло, які випадають у осад і видимі неозброєним оком.
Хід роботи: У пробірках приготувати розведення сироватки (в об'ємі 1 мл): 1: 100, 1:200, 1: 400, 1: 800, К. В останню пробірку для контролю наливають тільки фізіологічний розчин. Розведення сироватки проводять за схемою:
Після додавання антигену пробірки струсити і поставити на 4 год. в термостат, а потім витримати при кімнатній температурі.
| ІНГРЕДІЄНТИ | ПРОБІРКИ | |||||
| Фізіологічний розчин, мл | ||||||
| Імунна сироватка 1: 50, мл | переносити 1мл з 1-ї в 2-гу, з 2-ї в 3-тю і т. д.; з 5-ї пробірки 1мл вилити | |||||
| Одержуване розведення сироватки | 1: | 1: | 1: | 1: | 1: | К |
| Антиген | Діагностикум вносити в кожну пробірку по 1 краплі |
Облік реакції. Розглянути, не струшуючи, кожну пробірку і порівняти дослід із контролем. Звернути увагу на наявність помутніння, пластівців, осаду. Визначити характер аглютинації — зернистий осад (0-аглютинація), пластівцевий осад (Н-аглютинація). Визначити інтенсивність аглютинації додатніми знаками і відмітити останню пробірку з додатнім результатом, керуючись наступними ознаками: "4+"—наявність широкого з "нерівним" краєм осаду, рідина над осадом – прозора, при струшуванні пробірки—пластівцева чи зерниста завісина в прозорій рідині; "3+" — виражений осад меншого діаметру, над осадом – незначне помутніння рідини, при струшуванні – завісина пластівців чи зерен менших розмірів, ніж у попередньому випадку. При подальшому зменшенні діаметру осаду, розмірів пластівців чи зерен, збільшенню мутності рідини при струшуванні ступінь аглютинації відмічається "2+" чи "+". Наявність на дні пробірки невеликого, компактного осаду з рівним краєм, поява при легкому струшуванні мутних "змійок", які піднімаються із дна пробірки, а при сильному струшуванні — рівномірного помутніння рідини без зернистості і пластівців, свідчать про від'ємну реакцію аглютинації "—". Визначити титр антитіл в імунній сироватці. Зробити висновок про діагностичне значення реакції аглютинації.
Практичне значення. Розгорнутою реакцією аглютинації визначають титр сироватки, що дозволяє підтвердити протікання інфекційної хвороби.
Робота 4. Серологічна діагностика. Виявлення антитіл та встановлення їх титру в реакції непрямої гемаглютинації (РНГА).
Принцип методу. Реакція ґрунтується на використанні інертних частинок-носіїв, на яких адсорбовані молекули відомої розчинної специфічної речовини, що бере участь в реакції “антиген-атитіло”. В якості такого інертного носія у даному випадку використовують еритроцити.Завдяки використанню реагентів, адсорбованих на частинках носія,РНГА за своєю чутливістю значно перевищує реакцію прямої аглютинації, преципітації та РЗК.Інтенсивність реакції оцінюють візуально.
Хід роботи: Сироватку хворого розвели у лунках полістиролових планшетів 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, (в об'ємі 0,5 мл). У кожну лунку внесли еритроцитарний діагностикум. Контролі: К1 -завісина еритроцитів, не оброблених антигеном, + сироватка; К2 - сироватка, що не містить антитіл та еритроцитарний діагностикум. Реакція проходить при кімнатній температурі, облік проводиться через 30—45 хв. При позитивній реакції еритроцити аглютинуються внаслідок реакції між антитілами, які є в сироватці хворого, і антигеном, адсорбованим на еритроцитах. При цьому утворюється осад з нерівними краями по всьому периметру дна лунки - "парасолька". В контролях (негативна реакція) — еритроцити неаглютиновані, осідають у центрі лунки щільним скупченням з рівними краями. Визначити найбільше розведення сироватки, в якому пройшла реакція непрямої гемаглютинації.. За титр антитіл вважається найбільше розведення сироватки крові в якому пройшла реакція з утворенням комплексу антиген-антитіло у вигляді осаду на дні пробірки.
Практичне значення. Розгорнутою непрямою реакцією гемаглютинації визначать титр антитіл, що дозволяє підтвердити перебіг хвороби.
Робота 5. Реакція бактеріолізу.
Принцип реакції. Реакція бактеріолізу ґрунтується на приєднанні комплементу до комплексу “антиген-антитіло”. При цьому специфічні антитіла взаємодіють з антигенами бактерій і активують комплемент класичним шляхом.Внаслідок цього бактерії руйнуються і МПБ стає прозорим.
Хід роботи: Постановку реакції бактеріолізу проводять у двох пробірках з МПБ.
В обидві пробірки була засіяна жива культура мікроорганізмів. У дослідну пробірку внесена специфічна імунна сироватка і комплемент. Пробірки поміщають у термостат на добу. Провести облік реакції, спостерігаючи відсутність росту в дослідній пробірці і наявність росту (помутніння) в контрольній пробірці. Пояснити результати реакції, які спостерігаються.
Практичне значення. Реакція бактеріолізу in vitro є моделлю відповідних реакцій в організмі,що визначає відповідні патогенетичні механізми.
Робота 6. Реакція імунного гемолізу.
Принцип реакції. Реакції імунного гемолізу належать до реакції лізису,що ґрунтується на приєднанні комплементу до комплексу “антиген-антитіло”. При цьому специфічні антитіла взаємодіють з антигенами еритроцитів і активують комплемент класичним шляхом. Внаслідок цього еритроцити руйнуються і суміш реагентів стає прозорою (“лакова кров”).
Хід роботи: Постановка реакції гемолізу проводиться за схемою:
| Інгредієнти | Пробірки | |||||
| Еритроцити барана (3 % завісина) завісина) | 0,5 | – | 0,5 | 0,5 | 0,5 | |
| Еритроцити собаки (3 % завісина) | – | 0,5 | – | – | – | |
| Гемолітична сироватка (містить антитіла до еритроцитів барана) | 0,5 | 0,5 | – | 0,5 | – | |
| Комплемент 1:10 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | – | – | |
| Фізіологічний розчин | – | – | 0,5 | 0,5 | 1,0 | |
| Термостат 37°С—30 хвилин | ||||||
| Очікуваний результат | Ге-мо-ліз | Від-сутність ге-мо-лізу | Від-сутність ге-мо-лізу | Від-сутність гемолізу | Від-сутність гемолізу |
Облік реакції проводять після витримування пробірок у термостаті протягом 30 хв. при 37°С. Позитивний результат (гемоліз, лакова кров) відмічають у першій пробірці, де є всі необхідні інгредієнти реакції (антиген, специфічні антитіла, комплемент). Інші пробірки — контроль.
Пояснити, чому в контрольних пробірках не спостерігається гемоліз.
Практичне значення. Таку трикомпонентну реакцію гемолізу використовують для визначення титрів гемолітичних сироваток і якості препаратів комплементу.Крім того, вона є частиною таких серологічних діагностичних тестів,як реакція зв’язування комплементу.
Робота 7. Приготування інгредієнтів для реакції зв'язування комплементу:
Хід роботи: а) антиген — завісина вбитих мікробів. Перед постановкою РЗК визначають його титр і робочу дозу; б) антитіла — містяться в одній із досліджуваних сироваток. Перед введенням у реакцію всі сироватки інактивують (56°С — 30 хв.) для руйнування комплементу і створення оптимуму колоїдного стану; в) гемолітична система — сироватка крові кролика, попередньо імунізованого еритроцитами барана. Перед постановкою реакції встановлюють титр сироватки. Для реакції сироватку розводять до 1/3 титру і дають еквівалентну кількість 3% завісини еритроцитів барана; г) комплемент — складна білкова система, яка міститься в свіжій сироватці крові. Для реакції комплементом служить сироватка крові морської свинки. Титр і робочу дозу комплементу встановлюють у реакції гемолізу.
Робота 8. Постановка і облік реакції зв'язування комплементу (серологічна діагностика).
Принцип методу. РЗК ґрунтується на використанні двох систем “антиген-антитіло”, що конкурують між собою зв’язати комплемент. Перша з них є системою основного досліду, що містить антиген-антитіло. Один із цих реагентів є відомим, а інший - компонентом, що досліджується. До цієї ж системи додають комплемент. Друга,або гемолітична,система складається з еритроцитів барана і гемолітичної сироватки. РЗК відбувається у дві фази. У першій фазі антиген основного досліду взаємодіє з відповідним антитілом,якщо ці обидва реагенти знаходяться у пробірці. Для оцінки результату реакції до дослідної пробірки вносять гемолітичну систему. У другій фазі комплемент зв’язується комплексом ”антиген-антитіло” першої або другої системи, якщо у першій системі не вистачає одного компонента.
Хід роботи: РЗК ставлять за схемою:
| Інгредієнти | Пробірки | ||
| Досліджувана сироватка (у розведенні) | 0,5 | – | – |
| Сироватка завідомо здорової людини людини | – | 0,5 | – |
| Сироватка завідомо хворої людини | – | – | 0,5 |
| Антиген (у робочій дозі) | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Комплемент (у робочій дозі) | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Термостат 37°С— 1 годину, чи 4—8°С—18—20 годин |
| Гемолітична система | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Термостат 37°С - 30 хвилин | |||
| Очікувані результати | Затримка гемолізу | Гемоліз | Затримка гемолізу |
Провести облік реакції: "4+" – "повна затримка гемолізу" (компактний осад еритроцитів, безколірна рідина над осадом); "3+" – "майже повна затримка гемолізу" (осад еритроцитів, рідина над осадом – злегка зафарбована); "2+" – "часткова затримка гемолізу" (невеликий осад еритроцитів, інтенсивно зафарбована рідина над осадом); "+" – "слабка затримка гемолізу" (осад відсутній, зафарбована непрозора рідина – “лакова кров”); "–" - "гемоліз" (зафарбована прозора рідина).
Практичне значення. РЗК більш специфічна, її застосовують у діагностиці сифілісу (реакція Вассермана), висипного тифу, туляремії, лістеріозу та інших бактеріальних інфекцій, а також багатьох вірусних та протозойних захворювань.
Складання протоколів. Описати принцип реакції (робота 1), принципи, методики постановки реакцій (роботи 2, 3, 4, 5, 6, 8).
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С. 328-337.
2. Воробьев А.А.-Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М.,2004.-С. 283-286.
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.181-183.
4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - С.-П., 2002. - С. 227-236.
5. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С.125-141.
6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.276-279.285-288.
7. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.21-25.
Заняття 13.
Тема: Серологічні реакції з мітками.
Актуальність. У всіх областях сучасної медицини використовується імунний аналіз, переважно, з діагностичною та аналітичної цілями. Використання діагностичних препаратів,мічених флюоресцентними барвниками, ферментами, радіоактивними мітками дозволяє значно підвищити чутливість реакцій і ідентифікувати біологічні компоненти (гормони, ферменти, нейропептиди, продукти імунної системи, антигени і т.д.) в низьких і дуже низьких концентраціях. Всі продукти, проти яких можливе отримання антитіл, виявляються цими методами. Знання основ імунологічної трансплантології дуже важливе для підбору трансплантантів та попередження процесів їх відторгнення.
Мета і завдання. Ознайомлення з принципами реакцій, технікою їх постановки та можливостями методів імуноферментного аналізу, імунолюмінесцентного аналізу, радіоімунного аналізу, полімеразної ланцюгової реакції, комплексу гістосумісності та основ трансплантології.
Практичні навики.
1.Вибрати препарати та скласти схему постановки прямої та непрямої реакції імунофлуоресценції
2. Дослідити препарат з використанням прямого методу люмінесцентної мікроскопії, виявити люмінесцентні комплекси антигенів з міченими антитілами
3. Вибрати компоненти реакції, скласти схему етапів постановки твердофазного ІФА
4. Поставити модельну реакцію та провести облік непрямої реакції ІФА.
Контрольні питання.
1. З якою метою і які мітки використовують в прикладній імунології?
2. Переваги реакцій з міченими сироватками над класичними. Можливість застосування їх для експрес-діагностики.
3. Принцип реакції імунофлуоресценції (РІФ).
4. Одержання антивидових мічених імуноглобулінів. Застосування їх для РІФ.
5. Імуноферментний аналіз. Інгредієнти для постановки прямого та непрямого ІФА.
6. Твердофазний ІФА та імуноблотінг.
7. Принцип постановки реакцій радіоімунного аналізу (конкурентний тип реакції, пряма та зворотня РІА).
8. Імунна електронна мікроскопія
9. Полімеразна ланцюгова реакція.
Тестові завдання.
1.Для одержання мічених антитіл використовують маркери:
A. Флуорохром
B. Альбумін
C. Ферритин
D. Латекс
E. Бактеріофаг
2. Для діагностики багатьох інфекційних захворювань існують діагностичні тест- системи для постановки ІФА. Виберіть компоненти, необхідні для ІФА з метою виявлення антитіл у сироватці хворого.
A. Антиген на твердій фазі, сироватка хворого, мічена ензимом антиглобулінова сироватка, субстрат
B. Сироватка хворого на твердій фазі, антиген, субстрат
C. Сироватка хворого, специфічний антиген, антиглобулінова сироватка, ензим, субстрат
D. Антиген, специфічна сироватка, ензим, субстрат
E. Сироватка хворого, специфічна сироватка з ензимом, субстрат
3. Виберіть компонент, необхідний для реакції імунофлуоресценції (виявлення бактерій у мазку прямим методом)
A.Сироватка хворого
B. Люмінесцентна сироватка проти імуноглобулінів людини
С.Стандартний антиген
D. Мічена антибактеріальна сироватка
E. Мічений анти видовий імуноглобулін
4. Який з названих препаратів необхідний для виявлення антигену, адсорбованого на твердій фазі методом ІФА?
A. Мічена сироватка проти глобулінів людини
B. Досліджувана сироватка, що містить антитіла
C. Комплемент
D. Cпецифічна мічена сироватка
Е.Стандартний антиген
5. Об’єктом розпізнавання для антигенрозпізнавального рецептора Т4-лімфоцита є:
А. Антиген чужерідний
B. МНС-II
C. Комплекс МНС-I з антигеном
D. Комплекс МНС-II з антигеном
E. МНС-I
Приклад тестів «Крок 1».
1.Під час спалаху гострої респіраторної інфекції з метою встановлення діагнозу грипу проводиться експрес-діагностика, яка ґрунтується на виявленні специфічного вірусного антигену в досліджуваному матеріалі (змив з носоглотки). Яку реакцію використовують для цього?
А. Преципітації
В.* Імунофлюоресценції
С. Опсонізації
D. Зв’язування комплементу
Е. Аглютинації
2.При багатьох інфекційних хворобах у крові хворого можна виявити антигени збудника. Яку реакцію слід застосувати, враховуючи, що рівень антигенемії низький?
A. *Твердофазний ІФА
B. Реакцію аглютинації
C. Реакцію непрямої гемаглютинації
D. Реакцію латекс-аглютинації
E. Імуноелектрофорез
3. Істотним недоліком мікроскопічного методу діагностики інфекцій є його недостатня інформативність у зв’язку з морфологічною подібністю багатьох видів мікроорганізмів. Яка імунологічна реакція дозволяє значно підвищити інформативність цього методу?
A. *Реакція імунофлюоресценції
B. Реакція Кумбса
C. Імуноферментний аналіз
D. Реакція опсонізації
E. Радіоімунний аналіз
4. При проведенні лабораторної діагностики гепатиту В в останні роки визначають наявність вірусної ДНК в крові хворого. За допомогою якої із перелічених реакцій встановлюють це?
A. * Ланцюгової полімеразної реакції.
B. Реакція непрямої гемаглютинації.
C. Реакція зв'язування комплементу
D. Імуноферментний аналіз
E. Реакція гальмування гемаглютинації
Ситуаційна задача.
У хворого за ходом міжреберних нервів з’явилася пухирцева висипка у вигляді обруча, з больовим синдромом. А. Яке дослідження найбільш ефективне для експрес-діагностики антигену у клітинах? В. Яке обладнання та які компоненти необхідні для постановки цієї реакції?C. За якими ознаками оцінюється результат реакції?
Зміст і хід заняття:
Робота 1. Облік реакції імунолюмінесценції.
Принцип реакції передбачає використання антитіл, молекули яких зв’язані з люмінесцентним барвником (мічені або позначені антитіла, мічені сироватки). Такі антитіла зв’язуються з антигенами, наприклад із антигенами на поверхні бактеріальної клітини і така клітина буде світитися при дослідженні в люмінесцентному мікроскопі (антитіла, які не зв’язалися з відповідними антигенами, відмиваються під час обробки мазка).
Хід роботи: Препарат-відбиток з лімфатичного вузла тваринки, що загинула від експериментальної інфекції обробили люмінесцентною сироваткою проти збудника хвороби. Після промивання і висушування препарат досліджують за допомогою люмінесцентного мікроскопу. Мікроскопічна картина: на блакитно-зеленому фоні препарату видно яскраво-зелені паличкоподібні бактерії, які світяться завдяки тому, що на їхній поверхні мічені люмінесцентні антитіла специфічно зв’язались з антигенами бактеріальної клітини. Замалювати препарат, скласти схему реакції.
Практичне значення. Реакцію прямої імунофлюоресценції використовують для вивчення клітинних антигенів, виявлення вірусу в заражених клітинах та бактерій і рикетсій в мазках. Так, для діагностики сказу, відбитки кусочків мозку тварин, підозрюваних на вірусоносійство, обробляють люмінесцентною антирабічною сироваткою. При позитивному результаті в цитоплазмі нервових клітин виявляються комплекси яскраво-зеленого кольору. На виявленні антигенів вірусів в клітинах відбитків зі слизової оболонки носа заснована експрес-діагностика грипу, парагрипу і аденовірусної інфекції.
Робота 2. Імуноферментний метод (ІФА).
Принцип методу. Антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв’язаний з ензимом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена з антитілом з мобілізованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші Для такої мітки широко використовується фермент – пероксидаза хрону, яка в залежності від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи. Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н2О2 і 5-аміносаліцилову кислоту). Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з антитілами, утворюючи комплекс антиген – антитіло, після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ензимом, зумовлює появу відповідного забарвлення.
Хід роботи: Виявити антигени збудника в досліджуваному матеріалі за допомогою реакції ІФА. На дні і стінках лунок полістиролового планшету адсорбовані специфічні антитіла. У лунки вносять декілька зразків досліджуваних матеріалів, у яких виявляють антиген. Після 30-ти хвилинної інкубації в термостаті лунки промити промивним розчином і внести кон’югат - антитіла, з’єднані з пероксидазою. Після 30-ти хвилинної інкубації знову промити лунки і внести суміш пероксиду водню і хромогену. Після 30-ти хвилинного витримування в термостаті реакцію зупиняють стоп-реагентом і відмічають номери зразків, у яких виявлено антиген (зміна кольору хромогена).
Робота 3. Виявлення антитіл у сироватках в реакції ІФА.
Хід роботи: У лунках планшету для ІФА адсорбований стандартний антиген. У лунки внесли зразки досліджуваних сироваток, а після інкубації та промивання - кон’югат (мічені пероксидазою антитіла проти імуноглобулінів людини). Після повторної інкубації та промивання внесено субстрат і хромоген. Відмітити, у яких зразках сироваток виявлено специфічні антитіла. Скласти схему реакції.
Практичне значення. Сучасні методи імунологічних досліджень при інфекційних хворобах дають можливість безпосереднього виявлення антигенів збудника, виявлення антитіл окремих класів - IgG, IgM, IgA. Експрес-методи характеризуються достатньо високою специфічністю, швидкістю виконання.
Робота 4. Полімеразна ланцюгова реакція.
Принцип реакції - синтез копій досліджуваного гена в спеціальних автоматичних приладах - ампліфікаторах. Основою тест-системи в ПЛР є праймери - синтетичні олігонуклеотиди, комплементарні до певної ділянки гена, що виявляється і фермент ДНК-полімераза. Система також містить нуклеотиди, з яких синтезуються копії гену. Цикл ПЛР складається з послідовних процесів синтезу і плавлення (розкручування ниток ДНК). Під час синтезу праймер приєднується до комплементарної ділянки ДНК-гена, який копіюється (ампліфікація), утворюючи двоспіральну структуру. З цієї двоспіральної ділянки ДНК-полімераза започатковує синтез копії гена. При нагріванні ця новосинтезована ДНК розкручується на 2 нитки, які в свою чергу, знову копіюються при охолодженні з утворенням чотирьох ниток. Після 30-40 циклів ген копіюється в достатніх кількостях і виявляється в реакції молекулярної гібридизації. Для цього одноланцюговий зонд (короткий фрагмент нитки ДНК) мітиться ферментом, ізотопом або іншою міткою. Отримані ДНК денатуруються (т.т. розділяються на поодинокі нитки). Після інкубації зонда з досліджуваним зразком вимірюють кількість поміченої ДНК, яка зв’язалась (вступила в гібридизацію) з нуклеїновими кислотами досліджуваної ДНК.
Хід роботи: Скласти схему полімеразної ланцюгової реакції, вказати її призначення і область застосування.
Практичне значення. За результатами цієї реакції можна підтвердити діагноз інфекційної хвороби ще до появи антитіл, це особливо важливо щодо збудників, яких неможливо виділити з організму або вони виділяються з труднощами (вірусні інфекції).
Складання протоколів. Описати хід постановки і результати реакції імунолюмінесценції (1), імуноферментного аналізу (2, 3), скласти схему полімеразної ланцюгової реакції (4).
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М., 2005. – C. 217-222, 314-320, 323-325.
2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология
и иммунология.-М., 2008.-С.289-294.
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. Київ, Медицина, 2009. – С.185-186, 327-328.
4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П.Практична мікробіологія: Посібник.Тернопіль.-Укрмедкнита. 2004,-С.145-149.
5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – С.-П., 2002. – С. 187-191, 236-237.
6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.288-293.
7. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.21-25, 50, 61.
Самостійна робота 4.
Тема: Сучасні методи діагностики інфекційних захворювань.
Актуальність. Висока чутливість і специфічність тестів, заснованих на основі новітніх технологій, що пов’язані з можливостями багаторазового посилення сигналу, які забезпечуються ферментними, хімічними та ізотопними мітками, використанням моноклональних антитіл дозволяє швидко та якісно визначати збудників інфекційних захворювань.
Контрольні питання.
1. Перспективи застосування новітніх технологій у швидкій діагностиці інфекційних хвороб та їх обмеженість.
2. Принципи використання ІХА (цитотестів на основі імунохроматографії) для скринінгової діагностики інфекційних захворювань.
3. Сучасні лабораторні технології: ДОТ-варіанти ІФА, проточна цитофлуориметрія, біомікрочіпи, мультипраймерна ПЛР, мас-спектрометрія, технологія PLEX-I, імуноблотінг, імунохемілюмінесценція, хМАР, піросквенування.
Тестові завдання.
1. Відомо, що найчутливішим методом, який дозволяє виявляти мінімальну кількість вірусу у матеріалі, є імуноферментний метод. Назвіть необхідний інградієнт для застосування цього методу:
А. Діагностична противірусна сироватка
В. Антивидова сироватка, кон’югована з ферментом
С. Сироватка, мічена ізотіаціанатом натрію
D. Праймер – синтетичні копії гену, або його специфічної послідовності
Е. Вірусний білок з відомою амінокислотною послідовністю
2. Для якого методу виявлення вірусних антигенів використовуються противірусні антитіла, мічені люмінесцентним барвником?
А. Імунолюмінесцентний метод, прямий
В. Імунолюмінесцентний метод, непрямий
С. Радіоімунний аналіз
D. Імуноферментний аналіз
Е. Реакція нейтралізації вірусу
3. Виявлення збудника мікоплазмозу за допомогою швидкого цитотесту базується на:
А. Фізико-хімічному розділенні речовин, при якому їх компоненти виділяються у вигляді окремих смужок або зон
В. Дослідженні мономерів, отриманих повною деполімеризацією інтактних або хімічно модифікованих оліго- або полісахаридів
С. Дослідженні інтактних полісахаридів і глікокон’югатів
D. Електрофоретичному поділі суміші антигенів в забуферному агарі та дифузії антисироватки на зустріч антигену та утворенні ліній преципітації
Е. На утворенні преципітатів при електрофорезі антигену в гелі, який містить антитіла
4. Одностадійний касетний тест для діагностики інфекційних хвороб базується на застосуванні імунного аналізу та моноклональних та поліклональних антитіл. Про який вид аналізу йдеться?
А. Імунолюмінесцентний метод
В. Імунохроматографічний метод
С. Радіоімунний аналіз
D. Імуноферментний аналіз
Е. ПЛР
5. Хемілюмінесцентні реакції засновані на здатності:
А. Люмінолу світитися при окисленні перекису водню
В. Конкуренції мічених (кон'югат) і немічених (досліджуваних) антитіл за зв’язування з антигеном, адсорбованим на твердій фазі
С.Взаємодії антигену (АГ) і антитіла (АТ) з використанням мічення одного з компонентів ферментом
D. Взаємодії антигену (АГ) і антитіла (АТ) з використанням мічення одного з компонентів радіонуклеїдом.
Е. Люмінолу світитися при відновленні перекису водню
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М., 2005. –
C. 217-222, 314-320, 323-325.
2. Воробьев А.А.-Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М.,2004.-С. 283-286.
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. Київ, Медицина, 2009. - с.
4. Застосування швидких тестів у діагностиці інфекційних хвороб. Методичні вказівки. В.П.Широбоков, І.В.Дзюблик, С.Г.Вороненко, В.Г.Порохницький та ін. Український хіміотерапевтичний журнал. № 1-2(9)-2004.
5. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник.Тернопіль.-Укрмедкнита. 2004,-С.145-149.
6. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – С.-П., 2002. – С. 187-191, 196-212, 215-216, 235-236.
7. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.288-293, 399.
Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.21-25, 50, 61.
8. Д.А.Черношей, Т.А. Канашкова. Методы иммуноанализа, основанные на применении меченых компонентов.- Минск, 2007.
Заняття 14.
Тема: Оцінка імунного статусу організму людини. Імунопатологічні стани. Типи гіперчутливості. Алергодіагностика. Імунокомплексна патологія при реалізації імунної відповіді в рамках трансплантаційного імунітету.
Актуальність. Знання лікарем стану імунітету конкретного пацієнта дозволяє приймати адекватні рішення щодо оперативного втручання, призначення лікувальних та профілактичних препаратів тощо.
Введення пацієнтам сироваток, інших лікувальних препаратів, споживання певних продуктів харчування, застосування засобів побутової хімії тощо може спричинювати розвиток алергії – патологічно підвищеної спотвореної реакції організму на антиген. Лікар повинен розуміти суть алергічних реакцій, знати заходи попередження та методи лікування цих станів.
Мета і завдання. Засвоїти: показники та методи оцінки імунного статусу організму; знання про гіперчутливість негайного та сповільненого типів; методи алергодіагностики.
Контрольні питання.
1. Показники оцінки імунного статусу людини.
2. Методи визначення кількості імунокомпетентних клітин та їх функціональної активності: реакція розеткоутворення, реакція бласттрансформації лімфоцитів, реакція гальмування міграції лімфоцитів.
3. Методи визначення класів імуноглобулінів.
4. Гіперчутливість негайної та сповільненої дії.
5. Механізм алергічних реакцій.
6. Анафілактичний шок, сироваткова хвороба, набряк Квінке інші патологічні процеси та їх профілактика.
7. Алергени, які використовуються для діагностики інфекційних хвороб.
8. Шкірні діагностичні алергологічні проби.
9. Алергодіагностика in vitro.
10. Методи виявлення сироваткового IgE.
11. Методи визначення IgE, фіксованого на клітинах.
Практичні навики.
Вміти: здійснювати облік реакцій розеткоутворення, бласттрансформації лімфоцитів, затримки міграції лімфоцитів; ставити та обліковувати тести на визначення схильності до алергії.
Тестові завдання.
1.При оцінці В-клітинної системи імунітету визначають рівень специфічних та неспецифічних імуноглобулінів в сироватці крові. За допомогою якого дослідження це здійснюється
А. Реакція аглютинації
В. Реакція затримки гемаглютинації
С. Імуноферментного методу
D. Реакції непрямої гемаглютинації
Е. Реакції преципітації
2. Який метод використовують для виявлення та підрахунку Т-лімфоцитів?
А. Реакцію розеткоутворення (ЕАС-розетки)
В. Реакцію розеткоутворення (Е-розетки)
С. Реакцію бласттрансформації лейкоцитів
D. Реакцію непрямої гемаглютинації
Е. Фагоцитарну активність нейтро-
фільних гранулоцитів
2.Антитілозалежною цитотоксичністю є гіперчутливість:
А. I-III типів
В. IV типу
С. I типу
D. II типу
Е. III типу
4.
Алергічні реакції сповільненого типу розвиваються за участю:
А. Імуноглобулінів А
В. Імуноглобулінів G
С. Цитотоксичних Т-лімфоцитів
D. Імуноглобулінів Е
Е. Імунних комплексів
5. Який тип алергічної реакції можна виявити при проведенні скарифікаційних проб при полінозі?
А. Клітинний
В. Імунокомплексний
С. Цитотоксичний
D. Реагіновий
Е. Змішаний
Ситуаційна задача.
Хворому призначена складна операція і з метою запобігання можливих ускладнень необхідно оцінити стан його імунітету. А. Які кількісні показники стану імунітету вивчаються? В. Які показники характеризують функціональний стан імунітету? С. Які методи використовуються для їх визначення?
Приклади тестів «Крок 1».
1. Хвора 27-ми років закрапала в очі краплі, до складу яких входив пеніцилін. Через декілька хвилин з’явився свербіж та печія тіла, набряк губ та повік, свистячий кашель; став падати артеріальний тиск. Які імуноглобуліни беруть участь в розвитку даної алергічної реакції?
A.*IgE та IgG
B. IgM та IgG
C. IgM та IgD
D. IgA та IgM
E. IgG та IgD
2. На 8-й день після введення протиправцевої сироватки з приводу брудної рани стопи у пацієнта підвищилася температура тіла до 380С, з’явилися біль в суглобах, висипка, свербіж. У крові – лейкопенія і тромбоцитопенія. Який тип алергічної реакції розвинувся?
A.* Імунокомплексна
B. Анафілактична
C. Цитотоксична
D. Стимулююча
E.Гіперчутливість уповільненого типу
3.У хворої дифтерією дитини через 10 днів після введення антитоксичної протидифтерійної сироватки, з’явилися висипання на шкірі, які супроводжувались сильним свербінням, підвищилася температура тіла до 38?С, з’явились болі в суглобах. Яку причину цих явищ Ви передбачаєте?
A.*Сироваткова хвороба
B. Анафілактична реакція
C. Атопія
D. Гіперчутливість уповільненого типу
E. Контактна алергія
4. До лікаря звернулася жінка зі скаргами на те, що у весняний період у неї з’являється нежить, сиплість голосу, почервоніння повік зі сльозотечею. Який тип алергічної реакції за Джелом і Кумбсом розвивається у цьому випадку?
А. Цитотоксичний
В. *Анафілактичний
С. Стимулюючий
D. Імунокомплексний
Е.Гіперчутливості уповільненого типу
5. У померлого від ядухи чоловіка, який багато років страждав на бронхіальну астму, при гістологічному дослідженні легень виявлено у просвіті бронхіол та дрібних бронхів багато слизу з вмістом еозинофілів, склероз між альвеолярних перетинок, розширення просвіту альвеол. Який з механізмів розвитку реакції гіперчутливості має місце?
А. Цитотоксичний
В. Цитоліз, обумовлений лімфоцитами
С.* Реагіновий
D. Гранульоматоз
Е. Імунокомплексний
Зміст і хід заняття:
Робота 1. Встановлення кількості Т-лімфоцитів за допомогою реакції розеткоутворення.
Принцип методу. Реакція ґрунтується на відмінностях рецепторної структури Т- і В-лімфоцитів. Т-клітини мають на своїй поверхні рецептори до чужорідних еритроцитів (наприклад, барана), завдяки чому відбувається спонтанне приєднання останніх до поверхні Т-лімфоцитів з утворенням розеток (РУК). Обробка еритроцитів барана антитілами (глобуліном, антиглобуліновою сироваткою) і комплементом дає можливість виявити розеткоутворення В-клітинами (ЕАС-РУК).
Хід роботи: Виділяють лімфоцити досліджуваної крові, інкубують їх з суспензією еритроцитів барана (оброблених або необроблених антитілами) і підраховують кількість РУК в мазку у процентному і абсолютному вираженні.
Дослідити під мікроскопом мазки, підрахувати кількість лімфоцитів у полі зору і виявити серед них розеткоутворюючі клітини. За розетку приймається клітина, яка адсорбувала на своїй поверхні не менше трьох еритроцитів.
Практичне значення. Визначення кількості Т- і В-лімфоцитів є одним із методів оцінки імунного статусу організму людини. У нормі кількість Т - лімфоцитів у периферичній крові складає 43 - 70%, а В-лімфоцитів – 15-20%.
Робота 2. Кількісне визначення субпопуляцій лімфоцитів за допомогою проточної лазерної цитометрії з використанням моноклональних антитіл з подвійною міткою.
Принцип методу. Метод грунтується на взаємодії моноклональних антитіл, мічених флюоресцентною міткою, з поверхневими антигенами лімфоцитів і наступним аналізом зразків на проточному лазерному цитометрі в програмі СимулСЕТ (або на люмінісцентному мікроскопі).
Хід роботи: До зразка крові додають одночасно два типи моноклональних антитіл, які мають на собі різні флюоресцентні барвники: флуоресцеїнізотіоціанат (ФІТЦ) та фікоеритрин (ФЕ). Таким чином розрізняються лімфоцити, які зв’язали на своїй поверхні тільки перший тип антитіл, тільки другий і обидва типи.
| Маркери | Медіатори | Функції |
| CD3 (Т-загальні лімфоцити) | Інтерлейкін-7, SCF (фактор стовбурової клітини) | Передача сигналу від α- і β-ланцюгів рецептора, що розпізнає антиген, у середину клітини, запускаючи процес її активації з наступною проліферацією |
| CD4 (Т-лімфоцити хелпери) Т-лімфоцити хелпери 1-го типу (Th1) Т-лімфоцити хелпери 2-го типу (Th2) | γ-інтерферон, інтерлейкін-2, фактор некрозу пухлин Інтерлейкін-4, інтерлейкін-5, інтерлейкін-10, інтерлейкін-13. | Допомога: а) В-клітинам перетворюватися на плазма-тичні антитілопродукуючі клітини; в) CD8-лімфоцитам перетворюватися на зрілу цитотоксичну Т-клітину; с) макрофагам здійснювати ефекти гіперчутливості сповільненого типу. Активація макрофагів, природних кілерів, дозрівання цитотоксичних Т-лімфоцитів-кілерів, забезпечуючи переважний розвиток клітинної імунної відповіді. Забезпечення розвитку гуморальної імунної відповіді та продукція цитокінів. |
| CD8 (Т-лімфоцити кілери/супресори) | Реалізація специфічних клітинних реакцій імунітету, лізис мішеней (алотранс-плантантів, вірусінфікованих клітин і клітин пухлин). | |
| CD16 (NK-клітини) | α-інтерферон, γ-інтерферон, інтерлейкін-1, інтерлейкін-2, лімфотоксин. | 1.Спонтанна клітинноопосередкована цитотоксичність. 2. Регуляторна функція. |
| CD20 (В-лімфоцити) | 1. Диференціювання в плазматичні клітини та продукція антитіл. 2. Роль антигенпрезентуючої клітини. | |
| CD23 (К-клітини) | Антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність. | |
| CD26 (Активовані Т- і В-лімфоцити, макрофаги) | Міграція лейкоцитів через базальну мембрану, зв’язування і транспорт аденозинової дезамінази. |
Практичне значення. Цей метод є сучасним методом кількісного визначення субпопуляцій Т-лімфоцитів для оцінки імунного статусу організму людини. У нормі кількість Т-хелперів складає у межах 25-85%, а Т-супресорів – 10-15%.
Робота 3. Облік реакції бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ).
Принцип методу. Т-лімфоцити в результаті стимуляції міогенами (фітогемаглютинін - ФГА, конковалін А – Кон-А) і В-лімфоцити в результаті стимуляції ліпополісахаридом перетворюються у великі бластоподібні клітини. Цей феномен називається бласттрансформацією лімфоцитів.
Хід роботи: До 1 мл середовища 199 з антибіотиками додають 20% інактивованої сироватки людини + мітоген або антигени у від титрованих дозах + 0,1 мл крові. Суміш у флаконах культивують 72 год. при 370 С в інкубаторі з СО2. Облік реакції проводять трьома способами: морфологічно, сцинтиляційним підрахунком або авторадіографією. При морфологічному підрахунку вміст флаконів переливають у центрифужні пробірки і центрифугують 5 хвилин при 1500 об/хв. Надосадову рідину зливають, осад ре суспендують і заливають 10 мл фіксатора, залишають стояти 10 хв., центрифугують 10 хв при 1500 об/хв.. Зливають над осадову рідину і осад повністю переносять на скельце. Мазок висушують до наступного дня, фарбують зо Романовським-Гімзою і підраховують кількість бластів на 200-500 лімфоїдних клітин.
У мазках визначають функціональну активність Т і В-лімфоцитів периферійної крові. Для цього підраховують відсоток бластів, утворених при дії мітогенів. Бласт — це велика клітина із збільшеним округлим ядром, яке містить вакуолі і займає більшу частину клітини, а цитоплазма має вигляд вузької сіро-блакитної смужки навколо ядра.
Практичне значення. Реакція слугує для оцінки проліферативної активності лімфоцитів, їх функціональної здатності до трансформації та розмноження під впливом антигенів, алергенів та мітогенів. Норма РБТЛ для Т-лімфоцитів складає 40-72%.
Робота 4. Реакції гальмування міграції макрофагів та лейкоцитів.
Принцип методу. Реакції ґрунтуються на тому, що сенсибілізовані лімфоцити під впливом специфічного антигена виділяють в оточуюче середовище розчинні медіатори – лімфокіни. Це фактори, які в присутності специфічного антигена (алергена) викликають інгібіцію (гальмування) міграції макрофагів і лейкоцитів. Феномен виявляють при додаванні антигена до суспензії клітин, які містять макрофаги і сенсибілізовані лімфоцити.
Хід роботи: Очищену суспензію лімфоцитів і макрофагів перитонеального ексудату, селезінки, лімфатичних вузлів набирають у капілярні трубочки і поміщають на дно мікрокамери з поживним середовищем і антигеном, до якого ці клітини є сенсибілізовані. Камеру інкубують 1-2 доби при температурі 370 С. В контролі (без антигену або при відсутності сенсибілізації) макрофаги мігрують з вільного кінця капіляра по дну камери. У дослідних капілярах вихід клітин пригнічений. Ступінь гальмування визначають за різницею площі міграції в досліді і контролі.
Практичне значення. Реакція дає змогу оцінити функціональний стан макрофагів та лейкоцитів. Чим більшою є різниця площ міграції в досліді і контролі, тим кращий функціональний стан клітин.
Робота 5. Визначення алергії до мікробних алергенів у пацієнтів, схильних до проявів бронхіальної астми за допомогою імуноферментного аналізу.
Принцип методу. В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при
цьому один з реагентів є зв’язаним з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки потрібен відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена і антитіла з кон’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.
Хід роботи: У лунках полістиролової планшети адсорбовані алергени золотистого стафілокока, епідермального стафілокока, піогенного стрептокока та пневмокока. В кожну лунку вносять сироватку крові пацієнтів, інкубують в термостаті, промивають буферним розчином і вносять мічені ферментом антивидові антитіла до IgE. Систему знову інкубують, помивають буферним розчином і вносять субстрат до ферменту та хромоген. Облік реакції здійснюють через 30 хв. Позитивну реакцію відмічають за зміною кольору хромогену візуально або за допомогою фотоелектрокалориметра.
Практичне значення. Метод є ефективним тестуванням алергії. Він виявляє стан сенсибілізації, тобто наявність антитіл при негайному типі гіперчутливості, і свідчить про те, що в обстежуваного пацієнта був контакт з даним алергеном.
Складання протоколів. Описати хід роботи, записати принцип методу та клінічну норму, замалювати “розетки” (робота 1). Записати принцип методу (робота 2). Записати принцип методу, клінічну норму та замалювати клітини-бласти (робота 3). Записати принцип методу та хід роботи (робота 4). Записати принцип методу та хід роботи (робота 5).
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005. - С. 314 - 320.
2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2008. - С.275-279.
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.167 - 176.
4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. –
5. Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С. 146 -148, 151 - 160.
6. Клінічна імунологія та алергологія (під ред. Проф. Дранніка Г.М.).- Київ., “Здоров’я”.- 2006.- С.141-177, 407-506, 682-844.
7. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - С. -П., 2002.- С.214 - 219.
8. Лаповець Л.Є. та співавт. Посібник з лабораторної імунології.- Львів, 2008.-С.136 - 149.
9. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С. 245 - 261.
10. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.21 – 25, 52 – 58.
11. Якобисяк М.Імунологія.-Вінниця., Нова книга.- 2004.- С.427-462, 485-550.
Самостійна робота 5.
Тема: Вроджені та набуті імунодефіцитні стани. Автоімунні процеси. Автоантигени. Автоантитіла.
Актуальність. У деяких випадках організм втрачає здатність чинити опір будь-яким інфекціям і відновлювати порушення своїх органів внаслідок ушкодження або вродженої недостатності функції однієї чи кількох ланок в імунній системі, що призводить до зниження або відсутності імунної відповіді та розвитку несумісних з життям патологій. Лікар повинен знати про такі випадки та вміти їх виявляти.
Контрольні питання.
1. Вроджені імунодефіцити.
1.1. Ізольовані дефекти В-системи імунітету.
1.2. Ізольовані дефекти Т-системи імунітету.
1.3. Комбіновані дефекти імунітету.
2. Набуті та вторинні імунодефіцити.
2.1. Імунодефіцит внаслідок механічної втрати імунокомпетентних клітин.
2.2. Імунодефіцит внаслідок дії фізичних факторів.
2.3. Імунодепресивна дія хімічних речовин.
2.4. Біологічні імунодепресанти.
Контроль виконання самостійної роботи.
1.У дитини 1-го року життя діагностована агамаглобулінемія “швейцарського типу”, що супроводжувалася відсутністю клітинних імунологічних реакцій. Який спосіб лікування може дати шанс продовжити життя хворого?
А. Лікування рекомбінантним інтерлейкіном
В. Пересадка стовбурових клітин від батьків
С. Пересадка тимусу
D. Пересадка тимусу і грудини
Е. Постійне введення імуноглобулінів донора
2.Виберіть комбінований ефект імунітету:
А. Синдром Ді-Джоржі
В. Агамаглобулінемія Брутона
С. Селективна недостатність імуноглобулінів
D. Синдром Віскотта-Олдріча
Е. Епізодична лімфопенія
3.Який з наведених імунологічних показників характеризує систему вродженої резистентності?
А. Фагоцитарний індекс
В. Рівень CD8+-лімфоцитів
С. Рівень CD22+-лімфоцитів
D. Рівень Fas-позитивних лімфоцитів
Е. Рівень Т-лімфоцитів
4.При якому імунодефіцитному стані, що має вірусну етіологію, уражаються Т-лімфоцити?
А. Синдром Ді-Джорджі
В. Агамаглобулінемія Брутона
С. Селективна недостатність імуноглобулінів
D. Синдром Віскота-Олдріча
Е. Синдром набутого імунодефіциту
5. У хворого з клінічними ознаками первинного імунодефіциту виявлено порушення функції антигенпрезентаційних імунокомпетентних клітин. Дефект структур яких клітин є можливим?
А. 0-лімфоцитів D. Т-лімфоцитів
В. В-лімфоцитів Е. Фібробластів
С. Макрофагів
Приклади тестів «Крок 1».
1. У чоловіка 27-ми років з клінічними ознаками імунодефіциту проведено імунологічні дослідження. Виявлено значне зниження кількості клітин, що утворюють розетки з еритроцитами барана. Який висновок слід зробити, аналізуючи результати дослідження?
A.* Зниження рівня Т-лімфоцитів
B. Зниження рівня натуральних кілерів (NK-клітин)
C. Зниження рівня системи комплементу
D. Недостатність клітин-ефекторів гуморального імунітету
Е. Зниження рівня В-лімфоцитів
2. Досить часто причиною набутих імунодефіцитів є інфекційне ураження організму, при якому збудники безпосередньо розмножуються в клітинах імунної системи і руйнують їх. Виберіть серед перерахованих захворювання, при яких відбувається означене:
A.* Інфекційний мононуклеоз, СНІД
B. Туберкульоз, мікобактеріоз
C. Поліомієліт, гепатит А
D. Дизентерія, холера
E. Ку-гарячка, висипний тиф
3.У хворого з клінічними ознаками імунодефіциту проведено імунологічні дослідження. Виявлено значне зниження кількості клітин, що утворюють розетки з еритроцитами барана. Який висновок слід зробити на основі даних аналізу?
A.*Зниження рівня Т-лімфоцитів
B. Зниження рівня В-лімфоцитів
C. Зниження рівня натуральних кілерів (NK-клітин)
D. Зниження рівня системи комлементу
E. Недостатність клітин-ефекторів гуморального імунітету
4.У хворого з клінічними ознаками первинного імунодефіциту виявлено порушення функції антигенпрезентації імунокомпетентним клітинам. Дефект структур яких клітин є можливим?
A.*Макрофаги, моноцити
B. Т-лімфоцити
C. В-лімфоцити
D. Фібробласти
E. 0-лімфоцити
5. У 12-річного хлопця часто виникають вірусні та бактеріальні інфекції, екзематозні ураження шкіри. Під час обстеження виявлено зменшення Т-лімфоцитів та IgM при нормальному вмісті IgА та ІgG. Який вид патології імунної системи спостерігається у хворого?
А. Гіпогаммаглобулінемія Брутона
В. Синдром Шерешевського-Тернера
С. Спадковий дефіцит системи комплементу
D. Гіпоплазія тимуса
Е. *Комбінований імунодефіцит
6. У тимусі призупинено утворення Т-лімфоцитів-хелперів. Які процеси імуногенезу, що відбуваються у сполучній тканині будуть порушуватися в першу чергу?
А. Фагоцитування сторонніх тіл
В. Утворення попередників Т-лімфоцитів
С.*Перетворення В-лімфоцитів у плазматичні
клітини
D. Опсонізації
Е.Фагоцитування антигенів макрофагами
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С. 311 – 314.
2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М.,2008.- 269 - 272.
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.176 - 180.
4. Клінічна імунологія та алергологія (під ред. Проф. Дранніка Г.М.).- Київ., “Здоров’я”.- 2006.- С.141-177, 407-506, 682-844.
5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С.-П., 2002.-С. 219 -224.
6. Лаповець Л.Є. та співавт. Посібник з лабораторної імунології.- Львів, 2008.-С. 149 - 167.
7. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.38 - 42.
8. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С. 266-267.
9.Якобисяк М.Імунологія.-Вінниця., Нова книга.- 2004.- С.485-551.
Заняття 15.
Тема: Імунопрофілактика та імунотерапія.
Актуальність. Застосуванняімунних препаратів є одним з найбільш ефективних засобів специфічної профілактики та лікування багатьох захворювань мікробного ґенезу. Вчасно проведена імунопрофілактика створює достатній рівень індивідуального та колективного імунітету і запобігає виникненню епідемій. Знання складу та механізму дії імунних препаратів дозволяє лікарю рекомендувати їх для профілактики та терапії багатьох захворювань.
Мета і завдання. Вивчення принципів імунопрофілактики та імунотерапії. Засвоєння методик приготування вакцин та імунних сироваток. Вивчення правил застосування та ознайомлення з умовами зберігання вакцинних та сироваткових препаратів.
Контрольні питання.
1. Вчення про імунопрофілактику (етапи розвитку, роль вчених).
2. Вакцини. Вимоги до вакцинних препаратів.
3. Класифікація вакцин.
4. Способи отримання вакцинних штамів для виготовлення живих вакцин. Суть феномена атенуації. Переваги і недоліки живих вакцин.
5. Вбиті та хімічні вакцини. Анатоксини, одержання. Генноінженерні вакцини, одержання, приклади.
6. Синтетичні, антиідіотипові вакцини. ДНК-вакцини, ліпосомальні, мікрокапсульовані та вакцини з трансгенних рослин.
7. Автовакцини. Виготовлення, застосування.
8. Контроль якості вакцин. Оцінка ефективності вакцинації.
9. Імунні сироватки. Одержання імунних сироваток.
10. Класифікація імунних сироваток за призначенням, спрямованістю дії, одержанням. Інші імунні препарати (донорський та плацентарний імуноглобуліни).
11. Моноклональні антитіла, практичне використання.
12. Застосування імунних сироваток. Можливі ускладнення.
13. Препарати, що застосовуються для попередження відторгнення трансплантату в осіб, яким здійснено пересадку органів.
Практичні навики.
1. Скласти схему отримання автовакцини.
2. Приготувати вбиту вакцину з культури стафілокока, виділеної від хворого.
3. Скласти схему отримання імунних сироваток.
4. Здійснити постановку та облік реакції флокуляції. Визначити титр антитіл в імунній сироватці.
5. Визначити склад, призначення та придатність вакцинних та сироваткових препаратів.
6. Визначити дозування антитіл у сироваткових препаратах (на прикладі демонстраційних препаратів).
Тестові завдання.
1.Виберіть серед названих метод, який використовують для виготовлення живих вакцин:
A.Ферментативна обробка бактерій і вірусів
B. Атенуація
C. Детоксикація і очистка
D. Зміна антигенної структури
E. Інактивація
2. Основний недолік живих вакцин:
A. Реактогенні
B. Сприяють створенню малонапруженого імунітету
C. Пірогенні
D. Можлива реверсія патогенних властивостей мікроорганізму
E. Активують лише клітинну ланку імунітету
3. Основним методом одержання генно-інженерних вакцин є:
А. Одержання реплікативної плазміди
В.Взаємодія вірусу і клітини
С. Внесення гену, що детермінує антиген, в клітину-продуцент
D. Внесення транспозонів у створену плазміду
Е. Рекомбінація двох видів бактерій
4. В тексті завдання приведені приклади застосування імунних препаратів. 1. Для створення штучного активного імунітету. 2. Для серологічної ідентифікації антигенів. 3. Для пасивної імунізації. 4. Для нейтралізації екзотоксинів. 5. Для вакцинації. Вкажіть, в яких з наведених прикладів застосовують імунні сироватки?
А. 1, 3, 4
В. 1, 2, 5
С. 2, 3, 5
D. 2, 3, 4
E. 1, 3, 4
5. Препаратом, який дозволяє успішно лікувати такі токсикоінфекції, як дифтерія, правець, ботулізм, тощо, є антитоксичні сироватки. Виберіть метод, який дозволяє одержати такі сироватки:
А. Ферментативний діаліз (діаферм)
В. Імунізація коней токсигенними бактеріями
С. Гіперімунізація коней препаратом, одержаним з токсину
D. Гіперімунізація кроликів відповідними токсинами з наступною очисткою.
E. Використання рекомбінантних методик
Приклади тестів «Крок 1».
1. Для вакцинації використовують токсин, оброблений формальдегідом(0,4%) при 37-40°С протягом кількох тижнів. Вперше такий препарат застосував для профілактики дифтерії Рамон. Що це за препарат?
А. *Анатоксин
В. Імуноглобулін
С. Антитоксична сироватка
D. Ад'ювант
Е. Вбита вакцина
2. Значну роль у профілактиці туберкульозу відіграє планова масова вакцинація проти туберкульозу новонароджених дітей віком 5-7 днів життя. При цьому застосовують вакцину:
A. *БЦЖ
B. АКДП
C. АДП
D. АД
E. АКП
3.У хворої дифтерією дитини через 10 днів після введення антитоксичної протидифтерійної сироватки, з’явилися висипання на шкірі, які супроводжувались сильним свербінням, підвищенням температура тіла до 380С, болями в суглобах. Яку причину цих явищ Ви передбачаєте?
A. *Сироваткова хвороба
B. Анафілактична реакція
C. Атопія
D.Гіперчутливість сповільненого типу
E. Контактна алергія
Ситуаційна задача.
Хворому на хронічний фурункульоз з млявим перебігом і низькою ефективністю антибактеріальної терапії призначено аутовакцину. А. Вказати форму імунітету, який індукується аутовакциною. В. Охарактеризуйте склад та властивості такого лікувального засобу. С. Опишіть методику отримання, принципи та правила застосування.
