Реакция преципитации (РП)

Исследуют пробы кожи на сибирскую язву. Пробы предварительно простерилизо-ваны в автоклаве.

Компоненты реакции: кусочек кожи измельчают. 1 г полученной массы помещают в пробирку, заливают 10 мл физра­створа и 30-40 мин кипятят в водяной бане (горячий способ постановки реакции). Другой вариант: 1 г измельченной кожи растирают в ступке с песком, заливают 0,3%-ным карболизированным физраствором (1:10) и 16-18 ч настаивают при комнат­ной температуре (холодный способ). Экстракт, который может содержать сибиреязвенный антиген (преципитиноген), фильтру­ют через асбестовую вату до полной прозрачности. Второй ком­понент — биофабричная преципитирующая сибиреязвенная сы­воротка. Перед постановкой реакции ее фильтруют.

Постановка реакции. Мерной пипеткой наливают в специальные преципитационные пробирки по 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой осторож­но по стенке пробирки наслаивают на сыворотку исследуемый экстракт в таком же количестве (метод наслаивания). При ис­пользовании метода подслаивания в пробирки наливают иссле­дуемый экстракт, а затем, опустив пастеровскую пипетку на дно пробирки, подслаивают под него преципитирующую сыворотку.

Реакция считается положительной, если в течение первых 15 мин с момента ее постановки на границе соприкосновения экстракта и сыворотки образуется серовато-белое кольцо. Если это кольцо недостаточно резко выражено, реакцию оценивают как сомнительную, а при отсутствии кольца — как отрицатель­ную.

Непосредственно перед постановкой реакции ставят контроли с ее компонентами:

1) сибиреязвенный антиген (биофабрич­ный) + преципитирующая сыворотка — реакция должна быть положительной;

2) сибиреязвенный антиген + нормальная сыво­ротка лошади — реакция должна быть отрицательной;

3) физра­створ + преципитирующая сыворотка — реакция должна быть отрицательной.

Реакция агглютинации (РА). Исследуют сыворотки крови животных на бруцеллез.

Компоненты реакции: пробы сывороток крови, еди­ный бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК, цветной бру­целлезный антиген для роз бенгал пробы, позитивная бруцеллез­ная и негативная сыворотки, фенолизированный (0,5%-ный) физраствор.

Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бен­гал антигентом (РБП). Реакцию проводят на чистых сухих эма­лированных пластинках с лунками при температуре 18-30 °С. С помощью шприца-полуавтомата или микропипетки вносят на дно лунок до 0,03 мл исследуемых сывороток. Затем в каждую лунку добавляют по 0,03 мл цветного антигена. При исследова­нии сывороток крови овец, коз, буйволов и северных оленей достаточно 0,015 мл антигена. Антиген и сыворотки тщательно смешивают, распределяя полученную однородную смесь по всей поверхности лунки. Пластинку осторожно покачивают. Реакцию учитывают в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном. При наличии выраженной агглютинации окрашен­ных бруцелл антигена, проявляющейся образованием розовых хлопьев, реакцию считают положительной, а при отсутствии аг­глютинации (смесь остается равномерно окрашенной) — отрица­тельной. Если кровь была доставлена из благополучных хозяйств, все сыворотки с положительной РБП не позже чем на следую­щий день исследуют в РА и РСК. Окончательная диагностичес­кая оценка сомнительна только при положительной РБП и отри­цательных РА и РСК. В остальных случаях она положительная. По аналогичной схеме оценивают результаты исследований сы­вороток крови крупного рогатого скота, буйволов, лошадей и верблюдов из неблагополучных хозяйств. Но овец, коз, свиней и северных оленей из таких хозяйств признают больными бруцел­лезом при положительных результатах РБП без дополнительных исследований.

Перед постановкой РБП ставят контроль антигена с негатив­ной и позитивной бруцеллезными сыворотками и контроль анти­гена на спонтанную агглютинацию: к 0,03 мл антигена добавля­ют 0,03 мл физраствора.

Классический (пробирочный) метод РА. Реакцию с сыворотка­ми крови крупного рогатого скота проводят в объеме 1 мл в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400. Контроли: с негативной сывороткой в тех же разведениях и с позитивной бруцеллезной сывороткой до ее предельного титра.

Для исследования каждой сыворотки требуется 5 пробирок. В первую из них вносят 0,1 мл сыворотки и добавляют 2,4 мл физраствора (основное разведение 1:25). В третью, четвертую и пятую пробирки вливают по 0,5 мл физраствора. Затем из первой пробирки переносят во вторую и третью по 0,5 мл основного разведения сыворотки. После смешивания 0,5 мл содержимого третьей пробирки переносят в четвертую и так же — из четвертой в пятую, после чего из пятой пробирки удаляют 0,5 мл получен­ной смеси. Затем во вторую, третью, четвертую и пятую пробир­ки добавляют по 0,5 мл антигена, разбавленного физраствором в соотношении 1:10. Так получают требуемые разведения сыворот­ки. В первую пробирку антиген не вносят (контроль качества сыворотки). Сыворотки разливают микропипеткой (с грушей), а при массовых исследованиях — групповыми дозаторами Флорин-ского.

Штатив с пробирками осторожно встряхивают, помещают на 16-20 ч в термостат при 37-38 °С, затем в течение 1 ч выдержи­вают при комнатной температуре и проводят учет реакции.

Учет начинают с контролей. Ход реакции нормален, если в контроле с негативной сывороткой получен отрицательный ре­зультат, а с позитивной бруцеллезной сывороткой — положитель­ный. Результаты определяют в крестах. Четыре креста (++++) — полное просветление жидкости и наличие ясно выраженного осадка в виде зонтика. При встряхивании пробирки зонтик раз­бивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации). Три креста (+++) — неполное просветле­ние жидкости и хорошо выраженный зонтик (75% агглютина­ции). Два креста (++) — слабое просветление жидкости и уме­ренно выраженный зонтик (50% агглютинации). Один крест (+) — едва заметное просветление жидкости, зонтик выражен слабо (25% агглютинации). Минус (—) — просветления жидкос­ти нет, зонтик не образовался, на дне пробирки виден осадок в виде точки, при легком встряхивании пробирки образуется рав­номерная взвесь.

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на два креста. У крупного рогатого скота бруцеллез считают установленным при положительной РА в титре 1:200 и выше, т.е. при наличии в 1 мл сыворотки не менее 200 ME антител.

Реакция связывания комплемента (РСК). Сущ­ность реакции. При добавлении к сыворотке, содержащей определенные антитела (в нашем примере — бруцеллезные), соот­ветствующего антигена, а затем комплемента происходит соеди­нение этих трех компонентов (бактериолитическая система). Факт указанного соединения выявляют при внесении в бактериолитическую систему второй, гемолитической системы, состоящей из гемолизина и эритроцитов барана. При отсутствии в исследуемой сыворотке антител к примененному в реакции антигену произой­дет гемолиз эритроцитов, так как комплемент, не связавшийся в первой системе, соединится с гемолизином во второй, гемолити­ческой системе.

Компоненты реакции: испытуемая и контрольные (не­гативная и позитивная бруцеллезная) сыворотки крови крупного рогатого скота; антиген бруцеллезный, единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном предприятием-изготовителем; комплемент — свежая, консервированная или сухая сыворотка крови морской свинки; гемолитическая сыворотка (гемолизин) в удвоенном титре, указанном изготовителем; эритроциты бара­на — 2,5%-ная (от осадка) взвесь в физрастворе; физраствор. В день постановки реакции испытуемую и контрольные сыворотки инактивируют в водяной бане при 60-62 °С в течение 30 мин.

Перед постановкой главного опыта проводят титрование ком­племента в гемолитической и бактериолитической системах. Пе­риодически (один раз в три месяца и каждую новую серию) титруют и гемолизин.

Титрование гемолизина. Вначале готовят основное разведение гемолизина — 1:100 (0,1 мл гемолизина + 9,9 мл физраствора). Затем из основного готовят разведения 1:500; 1:1000 и т.д. до 1:4000 по следующей схеме:

 

Основное разведение Физиологический раствор, мл Получаемое разведение

гемолизина 1:100, мл

0,4 1,6 1:500

0,1 0,9 1:1000

0,1 1,4 1:1500

0,1 1,9 1:2000

0,1 2,4 1:2500

0,1 2,9 1:3000

0,1 3,4 1:3500

0,1 3,9 1:4000

 

В пробирки вносят по 0,2 мл каждого разведения гемолизина и добавляют по 0,2 мл комплемента в разведении 1:20, по 0,2 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов, по 0,4 мл физраствора. Пробирки встряхивают, ставят в водяную баню при 37-38 °С на 10 мин и затем учитывают результат. Титр гемолизина — его наименьшее количество, необходимое для полного гемолиза в течение 10 мин 0,2 мл взвеси эритроцитов в присутствии 0,2 мл комплемента, разведенного 1:20. Рабочий титр должен быть в 2 раза выше.

Титрование комплемента в гемолитической системе. Компле­мент в разведении 1:20 разливают в пробирки в дозах от 0,02 до 0,2 мл с интервалами по 0,02 мл. В каждую пробирку добавляют физраствор до объема 0,2 мл. Затем во все пробирки вносят по 0,2 мл гемолизина в удвоенном титре и по 0,2 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов. Следующий этап — добавление физраствора по 0,4 мл. После встряхивания пробирки на 10 мин помещают в водяную баню при 37-38 °С и учитывают результат. Титр ком­племента — его наименьшее количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов.

Титрование комплемента в бактериолитической системе. Оно позволяет окончательно определить дозу комплемента для систе­мы с испытуемой сывороткой и антигеном. Используют инактивированные позитивную бруцеллезную и негативную сыворотки. Их разводят физраствором 1:5 и разливают по 0,2 мл: каждую в два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент, разведенный 1:20, в возрастающих дозах: от 0,02 до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл. Недостающее до 0,2 мл содержимое пробирок дополняют физраствором. После розлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл антигена в рабочем разведении, а во второй ряд — по 0,2 мл физраствора. Пробирки встряхивают и на 20 мин ставят в водя­ную баню. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл гемоли­тической системы (0,2 мл гемолизина в рабочем титре и 0,2 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов) и вновь ставят на 20 мин в водя­ную баню при
37-38 °С. После этого учитывают результат. Титр комплемента в бактериолитической системе — его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз взвеси эритроцитов в пробирках с негативной сывороткой с антигеном и без него, а также в пробирках с позитивной сывороткой без антигена при задержке гемолиза в пробирках с позитивной сывороткой с анти­геном.

Проведение главного опыта. Испытуемую сыворотку исследу­ют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль). Реакцию проводят в объеме 1 мл — каждый компо­нент берут в объеме 0,2 мл в установленном рабочем титре (разведении). Контроли главного опыта: негативная и позитив­ная бруцеллезная сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с антиге­ном и 1:5 без антигена; гемолитическая система (гемолизин и эритроциты по 0,2 мл и 0,6 мл физраствора).

После розлива компонентов бактериологической системы (сыворотка + антиген + комплемент) пробирки в течение 20 мин выдерживают в водяной бане. Затем разливают компоненты ге­молитической системы и вновь на 20 мин помещают пробирки в водяную баню. Результаты реакции учитывают через 3-4 ч после извлечения штативов из водяной бани и оценивают в крестах: ++++ — отсутствие гемолиза; +++ — гемолиз 25% эритроцитов; ++ — гемолиз 50% эритроцитов; + — гемолиз 75% эритроцитов; — (минус) — полный гемолиз эритроцитов, отсутствие осадка, интенсивное окрашивание жидкости гемоглобином. Реакцию признают положительной при задержке гемолиза на 2-4 креста в одном или двух разведениях испытуемой сыворотки и сомни­тельной — при задержке гемолиза с оценкой в один крест. При получении сомнительного результата сыворотки крови от соот­ветствующих животных через 15-30 дней исследуют повторно. Если сомнительная РСК получена дважды, животных считают положительно реагирующими.