Берінг і Кітаза-то (1890), Ру й Віланд (1893) встановили, що сироватка крові піддослідних тварин, імунізованих токсином правцю (ослабленим трихлористим йодом), має властивість нейтралізувати цей токсин. Одержана сироватка мала лікувальний ефект при введенні в організм хворої на правець тварини.
Це наукове відкриття і лежить в основі виготовлення лікувально-профілактичних сироваток. Їх одержують із сироватки крові тварин, гіперімунізованих бактеріальними або ж вірусними антигенами (живими чи інактивованими мікроорганізмами, анатоксинами, чи чужорідними тваринам білками). До лікувально-профілактичних сироваток належать сироватки реконвалесцентів (одержані від тварин, що перехворіли на інфекційні захворювання) та гіперімунні сироватки, які містять значну кількість специфічних антитіл.
Гіперімунні сироватки готують шляхом гіперімунізації тварин – багаторазовим із нарощуванням кількості введенням тваринам антигену для максимального імунізаторного подразнення, яке проявляється нагромадженням у крові значної кількості специфічних антитіл.
Усі лікувально-профілактичні сироватки, що використовують у ветеринарній медицині, можна розподілити на антибактеріальні, антивірусні, антитоксичні. В усіх випадках єдиним способом їх одержання є імунізація тварин. Антибактеріальні сироватки мають більш виражений лікувально-профілактичний ефект, ніж антивірусні, що пов'язано з внутрішньоклітинним типом паразитування вірусів, де вони стають недосяжними для антитіл.
Після введення в організм реципієнта дія сироватки розпочинається через 2-4 год. і продовжується 8-15 діб. При подальшому введенні сироватки тривалість її дії скорочується, особливо якщо сироватка, одержана на гетерологічних видах тварин. Це зумовлено появою у реципієнта антитіл на чужорідний білок, що може проявлятися патологічною імунною реакцією (сироваткова хвороба).
Основні вимоги до імунних сироваток:
- високий титр специфічних антитіл, що визначає їх активність;
- максимальне очищення одержаних сироваток від баластних речовин.
Високої активності сироватки досягають застосуванням високоімуногенних і очищених антигенів для імунізації тварин, розробленням найбільш ефективних схем і методів імунізації, підбором відповідних продуцентів.
Антигени повинні мати високу імуногенну активність при невисокій їх токсичності. Антигенна активність підвищується при більшій їх кількості на одиницю об'єму препарату, або ж маси тварин. Однак підвищення антигенної активності відбувається до відповідного рівня, який є різним для різних антигенів і продуцентів. При надмірно високій дозі антигену може виникати так званий «імуногенний параліч», тобто стан, коли організм продуцента стає ареактивним до будь-якої більшої дози антигену.
Вимоги до тварин – продуцентів сироваток:
- велика маса (велика кількість сироватки);
- висока реактивність (продукувати активні сироватки);
- зручність для догляду.
Для одержання лікувально-профілактичних сироваток гіперімунізують дорослих коней, волів, ослів, овець. Використання коней для одержання сироваток економічно вигідно і зумовлене тим, що їх організм має унікальну властивість – відповідати на гіперімунізацію різними антигенами, утворенням великої кількості специфічних антитіл. Від коней при кожному кровопусканні можна взяти велику кількість крові для одержання сироватки, їх легко доглядати.
Тварин на біофабрики закупляють лише із благополучних господарств. Надалі їх витримують на карантині протягом 90 днів, досліджуючи на різні хвороби (туберкульоз, сап, бруцельоз та ін.). Тварин добре доглядають, повноцінно годують, вигулюють, чистять. Після закінчення терміну використання туші продуцентів утилізують.
ПРОТИЯЩУРНИЙ ІМУНОЛАКТОН
Особливе місце у профілактиці ящуру займає протиящурний імунолактон. Він являє собою спеціально висушений компонент сироватки молока корів із умістом антитіл проти певного серотипу вірусу ящуру, який використовують для внутрішньовим'яної імунізації. На вигляд це білий чи жовтий порошок.
Внутрішньовим'яна імунізація корів-продуцентів ґрунтується на тому, що при внутрішньоцистернальному введенні антигену він у дисперсному стані проникає у паренхіму вим'я, регіонарні лімфовузли та селезінку і втягує їх клітини в імунологічну відповідь. Більша частина специфічних антитіл утворюється у паренхімі імунної чверті молочної залози, де в секреті титр антитіл вищий у шість разів, ніж не імунізованої.
Протиящурний імунолактон використовують телятам, ягнятам, поросятам, у неблагополучних щодо ящуру господарствах, із профілактичною й лікувальною метою. Розчиняють препарат дистильованою водою у співвідношенні: на одну частину препарату – дві частини води. Вводять підшкірно в дозі 0,1 – 0,4 г сухої речовини на 1 кг маси тіла.
ІМУНОГЛОБУЛІНИ
У 1937 р. відомий хімік А. Тизеліус установив, що білки сироватки крові мають неоднакову рухливість в електричному полі. Альбуміни рухаються швидше (молекулярна маса не більше 75 тис. М.О.), а глобуліни повільніше (150-190 тис. М.О.) і розділяються у цьому разі на три фракції. А. Тизеліус визначив їх як альфа, бета й гамма. Він же встановив, що імунні антитіла (імуноглобуліни) зв'язані з найбільш рухомою фракцією – гамма-глобуліном. Значне збільшення вмісту імуноглобулінів у сироватці крові тварин відбувається після їх щеплення чи перехворювання (однак буває і навпаки) в основному за рахунок утворення специфічних антитіл.
Згідно з фізико-хімічною структурою, антигенністю і біологічною функцією імуноглобуліни ділять на 5 класів: IgA, IgD, IgE, IgJ, IgM. Імуноглобуліни утворюються в імуноцитах у процесі гуморальної імунної відповіді. Вони з’єднуються з тими антигенами, які викликають їх утворення. Імуноглобуліни зустрічаються у вільному стані, головним чином, у плазмі крові й інших рідинах організму (їх виявляють на клітинах лімфоїдної системи в основному в B-лімфоцитах).
Способи одержання імуноглобуліну:
- висолювання – розчинами нейтральних солей (амонієм сірчанокислим);
- спиртово-хлороформний;
- хроматографічний;
- електрофоретичний (електрофорезом).
На виробництві для виготовлення імуноглобуліну найширше використовують спиртовий і поліетиленгліколевий методи. Принцип їх дії полягає у преципітації етиловим спиртом або поліетиленгліколем молекул білка, у зв'язку з чим зменшується їх розчинність і вони випадають в осад. Які білки будуть осідати, залежить від іонної сили розчину, рН і температури, регулюванням яких досягається максимальний вихід імуноглобулінів.
Першим етапом одержання специфічних імуноглобулінів (проти сибірки, ящуру, хвороби Ауєскі) є гіперімунізація тварин-продуцентів, за тим же методом, що і для одержання лікувально-профілактичних сироваток. Порядок взяття крові та її обробки приблизно такий самий. Потім із плазми одержують імуноглобуліни.
Широке використання в практиці ветеринарної медицини знаходить неспецифічний (нормальний) глобулін. Препарат підвищує природну стійкість організму, ліквідує імунодефіцит та стимулює ріст і розвиток тварин.
Одержані на біофабриках імуноглобуліни перевіряють на стерильність, активність і нешкідливість.
Перспективним напрямом вважається використання моноклональних антитіл. Це, не що інше, як імуноглобуліни, що синтезовані одним клоном клітин. Метод був розроблений в 1975 р. (Келер Г. і Мільщтейн К.) і ґрунтується на використанні клітинних гібридів: гібридом від злиття лімфоцитів імунізованих тварин із культивованими в поживному середовищі пухлинними клітинами мієлом. Гібридомна клітина від лімфоцита одержує можливість синтезувати відповідне антитіло, а від мієломної клітини – невпинно розмножуватися, чого не може лімфоцит. Клон гібридної клітини можна розмножити у необмеженій кількості. Переваги моноклональних антитіл:
1. Одержання у необмежених кількостях і в чистому вигляді.
2. Взаємодіють лише з одним антигеном, і тому вважаються ідеальним діагностичним і лікувально-профілактичним засобом.
3. Можна одержувати за допомогою клонування, навіть якщо імунізацію проводили недостатньо очищеним антигеном.
Недоліком моноклональних антитіл вважають складність одержання і високу вартість таких препаратів.
БАКТЕРІОФАГИ
У 1898 р. М.Ф. Гамалея спостерігав саморозчинення культури сибірки, що й послугувало поштовхом до вивчення бактеріофагів.
Значний внесок у вивчення фагів зробив професор І.П. Ревенко.
Бактеріофаг (пожирач бактерій, мікробофаг, бактеріальний вірус) – специфічний субмікроскопічний антиген, що має властивість розчиняти мікробні клітини завдяки властивостям вірусів. Це вірус, що паразитє у бактеріях, який проникає в них та перебудовує їх метаболізм на синтез фага. В одній клітині утворюється до 50 млн. вірусних частинок, які виходять із бактерій й уражають сусідні клітини. У деяких випадках нуклеїнова кислота фага після проникнення в бактерію включається в її геном і передається за спадковістю із збереженням можливості активізації фага. Це явище називається лізогенією і може завдавати великих збитків під час виробництва бактеріальних вакцин.
Фаги – це частинки в більшості булавоподібної форми, які складаються із круглої головки діаметром 60 – 95 нм., і прямих чи вигнутих хвостових відростків завдовжки 100 – 200 нм. Деякі фаги мають вигляд багатогранних тілець без хвостового відростка. Фагова частинка складається із зовнішньої білкової оболонки і внутрішнього наповнення, яким є довга нитка ДНК або РНК. Фаги мають антигенні властивості і видову специфічність.
Бактеріофаги можна використовувати з лікувальною, профілактичною і діагностичною метою. Фаготерапію й фагопрофілактику проводять (у комплексі з іншими методами) при сальмонельозі та колібактеріозі телят, поросят, пулорозі-тифі птиці. З метою фагодіагностики використовують явище паразитування фага лише на певному виді бактерії чи навіть серотипі. Ідентифікують за допомогою фагів лише чисті культури бактерій, що виділені бактеріологічними методами.
ІНТЕРФЕРОН
У 1957 р. англійські вчені Айзекс і Ліндеман установили, що при вірусних інфекціях у клітинах утворюється особлива речовина – інтерферон. Його дія спрямована на забезпечення гомеостазу організму через широкі контрольно-регулюючі функції. Найважливіші функції: противірусна, протипухлинна та імунорегулююча. Інтерферон є глікопротеїдом, який виробляють клітини хребетних від риб до людини.
Існує три види інтерферону: альфа, бета й гамма (імунний). Синтезується він у відповідь на дію природних (віруси, ендотоксини, внутрішньоклітинні паразити) і синтетичних (високо- і низькомолекулярні) індукторів. Ними можуть бути також РНК, у тому числі синтетичні. Найактивнішими продуцентами інтерферону вважаються лімфоцити та макрофаги, а індукторами серед вірусів – вірус Нюкаслської хвороби, віруси Сендай, чуми свиней. У даний час інтерферон одержують двома методами:
1. Виділення із крові й розмноження в поживному середовищі лейкоцитів, фібробластів, клітин селезінки, які оброблені індукторами протягом 20 год. У цьому разі активізуються гени, що кодують інтерферон. Потім індуктор забирають і вносять свіже поживне середовище Ігла. У це середовище клітини виділяють інтерферон. Одержану суспензію центрифугують для відокремлення клітин і фільтрують. Перевіряють на стерильність, активність, нешкідливість. Активність одержаного лейкоцитарного та фібробластного інтерферону близько 1000 ОД/мл.
2. Ширше використання при одержанні інтерферону має метод генної інженерії. Називають його реафероном (рекомбінатним інтерфероном). Суть цього методу полягає у тому, що за допомогою плазмідного вектора ділянка геному лімфоцита, яка відповідає за синтез інтерферону, переноситься у геном кишкової палички.
Інтерферон є важливим неспецифічним фактором організму і синтезується майже зразу після попадання вірусу в організм. Індукований вірусом інтерферон течією крові й лімфи розноситься по організму, діє на неуражені вірусом клітини. Вважають, що в них утворюється противірусний білок, який потім пригнічує синтез вірусних інформаційних РНК у клітинах. У цьому разі інтерферони нетоксичні, не порушують функції клітин, але пригнічують розмноження клітин, що швидко діляться, включаючи пухлинні.
Таким чином, власний інтерферон організму запобігає зараженню клітин і має більш виражену противірусну профілактичну дію.
Однак природно створений інтерферон не завжди запобігає розвитку інфекційного процесу. Тому використовують готовий препарат (екзогенний інтерферон) або ж індуктор власного (ендогенний) інтерферону. Використання інтерферону має багато переваг:
§ широкий спектр дії, що особливо важливо при терапії вірусних пневмоентеритів молодняку;
§ дія його ґрунтується на активізації природних механізмів захисту організму на ранніх стадіях інфекційного процесу;
§ дія настає зразу ж після введення препарату.
Недоліки інтерферону:
° короткий період зберігання в організмі (до 12 год.);
° необхідність парентерального введення;
° через 2 – 3 дні після застосування спостерігається пригнічення захисних функцій імунної системи, що може проявлятися швидким розмноженням в організмі непатогенної мікрофлори (синьогнійної палички), некрозами й смертю тварин;
° видова специфічність для тварин;
° можливість виникнення алергічних реакцій при подальшому введенні;
° складність виробництва.
Рекомендовані дози інтерферону:
– профілактичні – 100-1000 ОД/кг, із метою лікування – 200-5000 ОД/кг – 1-2 рази на добу. Індуктори інтерферону (віруси, тілорон, штучні РНК) – вивчаються. Їх вводять парентерально 1-2 рази на добу, протягом тижня.
БАКТЕРІАЛЬНІ ПРЕПАРАТИ
З живих бактеріальних препаратів широко використовують пропіоново-ацидофільні та ацидофільні культури, бактерін-СЛ. Дію такої групи препаратів уперше обґрунтував І.І. Мечников у 1909 р. Вона ґрунтується на заселенні шлунково-кишкового каналу тварин корисною мікрофлорою, яка антагоністично діє на інші бактерії. Це запобігає заселенню його патогенними бактеріями й виникненню дисбактеріозу. Крім того, організм одержує вітаміни, поліпшується травлення й моторика шлунково-кишкового каналу.
У господарствах бактеріальні препарати готують безпосередньо перед використанням. Бактеріальну масу вносять у кип'ячене незбиране молоко і ставлять у тепле місце. Після нагромадження достатньої кількості бактерій молоко перетворюється у кисле. Такі препарати застосовують із профілактичною й лікувальною метою. Можна використовувати суспензію препарату в перевареній воді.
З інактивованих бактеріальних препаратів використовують коліпротектан, що являє собою екстракт із кишкової палички. Застосовують його з метою профілактики та лікування колібактеріозу телят і поросят. Препарат вводять перорально перед першим випоюванням молозива, а потім через 3 – 5 днів із кожною порцією корму.
Механізм дії коліпротектану полягає у виробленні специфічних захисних антитіл на слизових оболонках шлунково-кишкового каналу й прикріпленні частинок препарату до поверхні клітин так званої «кишкової кайми», що запобігає подальшому прикріпленню сюди патогенних штамів кишкової палички.
СТИМУЛЮЮЧІ ПРЕПАРАТИ
БІОСТИМУЛЯТОРИ
Це фармакологічні речовини, що активізують функції організму в цілому або окремі його системи. Використовують для підвищення резистентності організму тварин і стимуляції росту та відгодівлі тварин.
За походженням розрізняють рослинні (антибіотики та препарати за Філатовим), тваринні (ФСД, гормони, ферменти) й штучні (вітаміни) групи препаратів.
З препаратів тваринного походження широко використовують антисептик-стимулятор Дорогова (АСД), що є продуктом сухої перегонки тканин тваринного походження. Після перегонки одержують фракцію 2 (АСД-2), розчинну у воді, і фракцію З (АСД-З), нерозчинну у воді.
Використовують також препарати із тканин організму (кров, молоко) за Філатовим, гормони. Вивчають препарати із імунних тканин (тимусу й фабрицієвої бурси) для лікування набутих імунодефіцитів. З цією метою використовують також неспецифічний глобулін і інтерферон, які стимулюють функції імунної системи.
ДІАГНОСТИЧНІ ПРЕПАРАТИ
Діагностичні біопрепарати використовують для виявлення інфікованих тварин і птиці з тим, щоб якомога раніше ізолювати їх із гурту, і таким чином не допустити поширення інфекційної хвороби. Основною умовою діагностичних досліджень є повне охоплення ними сприйнятливого до даного захворювання поголів'я тварин і птиці господарства чи населеного пункту у зумовлені планом терміни.
До діагностичних біопрепаратів, які використовують безпосередньо в господарствах, належать алергени, деякі антигени й препарати для лабораторної діагностики хвороби.
СИРОВАТКИ
У практиці ветеринарної медицини у наш час використовують великий асортимент специфічних діагностичних сироваток, які застосовують для ідентифікації збудників інфекційних захворювань і визначення їх типу та варіанта. Виробництво діагностичних сироваток принципово не відрізняється від виробництва лікувально-профілактичних. Крім того, нині виробляють діагностичні імуноглобуліни.
Основні вимоги до таких препаратів – щоб вони були високоспецифічними та чутливими, чого досягають за рахунок високої концентрації антитіл. Має значення також і підбір реципієнта. Як реципієнтів частіше використовують кролів, морських свинок, півнів, рідше – коней, ослів. Сироватка кролів цінна тим, що в ній мало видоспецифічних нормальних антитіл, які ускладнюють проведення серологічних досліджень (дають неспецифічні реакції). Цих тварин використовують при виготовленні бруцельозних, сальмонельозних, колібактеріозних, лептоспірозних, лістеріозних сироваток, а також препаратів для діагностики вірусної діареї, аденовірусної інфекції, респіраторно-синтиціальної інфекції. Від морських свинок одержують сироватки для типізації вірусу ящуру й комплемент (нативна сироватка морських свинок). Коней використовують для одержання сироватки для діагностики сибірки, сапу, інфекційного ринотрахеїту, парагрипу-3, інфекційної анемії коней і нормальної негативної сироватки.
Для імунізації готують ретельно очищені антигени (культури збудників сибірки, трьох видів бруцел, екстракт палички сапу та ін.). Дози їх значно менші, ніж для одержання лікувально-профілактичних сироваток. Від малих продуцентів кров беруть методом знекровлення. Одержану сироватку консервують фенолом, хінозолом. Для підвищення специфічності сироватки адсорбують антитіла, які можуть сполучатися з іншими антигенами, присутність антитіл проти яких небажана.
Перевіряють препарати на стерильність, активність (титр) і специфічність. Для діагностики використовують аглютинуючі, преципітуючі, гемолітичні, флуоресціюючі (молекули антитіла, одержані із флуоресціюючим барвником) сироватки та комплемент. Вводити їх тваринам із лікувальною або профілактичною метою забороняється.
АНТИГЕНИ
Біопрепарати, що використовуються у серологічних реакціях для виявлення специфічних антитіл.
Для реакції аглютинації (РА) використовують лише корпускулярні антигени (суспензію мікробних клітин або вкритих відповідним антигеном еритроцитів); для реакції преципітації (РП) та реакції зв'язування комплементу (РЗК) – дрібнодисперсні віруси або розчинні антигени (антиген сибірки).
Перевіряють антигени на стерильність та активність.
АЛЕРГЕНИ
Алергенами в широкому розумінні цього слова можуть бути найрізноманітніші речовини – від високомолекулярних до простих, і навіть окремі хімічні елементи (йод). Однак алергени, які використовують для діагностики інфекційних захворювань, є продуктами переробки відповідних збудників у так звані неповні антигени. Вони можуть викликати алергічну реакцію при попаданні в сенсибілізований (контамінований) збудником організм. Так алергени сполучаються з уже виробленими антитілами або ж сенсибілізованими клітинами. Однак самі вони майже не індукують їх появлення на відміну від повних антигенів. Ефективні для виявлення у латентному періоді хвороби.
Вперше запропонували використовувати алергени для діагностики інфекційних хвороб Р. Кох в 1890 р. (туберкулін), О.М. Кальнінг і X.I. Гельман в 1892 р. (малеїн).
Алергени – продукти життєдіяльності відповідних мікробів або їх переробки різними методами (гідролізом, екстракцією чи ін.). В досліджуваний організм алергени вводять внутрішньошкірно, на слизову ока, рідше підшкірно й дуже рідко внутрішньовенно.
У практиці ветеринарної медицини алергени використовують для діагностики туберкульозу – туберкуліни (ППД для ссавців і птиці, комплексний алерген з атипових мікобактерій (КАМ)); бруцельозу – бруцелін; сапу – малеїн; паратуберкульозу – туберкулін (ППД).
Туберкулін ППД (протеїн пурифієд дериват), на відміну від альттуберкуліну, являє собою осаджені й очищені білки фільтрату культури мікобактерій бичачого або пташиного типів, вирощених на штучному безбілковому середовищі. Для виділення специфічних білків фільтрат осаджують, центрифугують, проводять діаліз і ліофілізацію.
У 1952 р. введена міжнародна одиниця – Т.О. ППД. Одна туберкулінова одиниця ППД для ссавців містить 0,000028 мг, для птиці – 0,0000726 мг сухого специфічного білка.
Комплексний алерген з атипових мікобактерій (КАМ) являє собою суміш алергенів, виготовлених із штамів атипових мікобактерій – фотохромогенної, нефотохромогенної і швидко зростаючих груп. Оскільки непатогенні атипові мікобактерії можуть індукувати у тварин параалергічну реакцію на туберкулін, то для визначення характеру сенсибілізації організму тварин і застосовують КАМ.
Малеїн являє собою фільтрат, інактивованої нагріванням, бульйонної культури збудника сапу. Для його одержання використовують високовірулентну типову культуру збудника, яку вирощують на гліцериновому МПБ протягом 4 міс. Готову культуру стерилізують, відстоюють протягом 2 міс для екстрагування, освітлення і розфасовують.
Бруцелін – це специфічні речовини, виділені із бруцел. Його розроблено А.Н.Касьяновим і Е.С.Орловим у 1968 р.
Контролюють алергени на стерильність, активність та нешкідливість.
