Тақырып. Гендік ақпаратты таратудағы нуклеин қышқылдарының ролі

1. ДНҚ репликациясының схемасы (консервативтік және жартылай консервативтік, дисперсиялық).

2. Мезельсон мен Сталь дәлелдеген жартылай консервативтік репликация

3. Репликацияның механизмдері туралы қазіргі көзқарас. Репликация ферменттері әрекеттерінің ерекшеліктері.

4. ДНК-полимераза ферментінің құрылысы мен қызметі.

1. ДНҚ репликациясының схемасы (консервативті, және жартылай консервативті, дисперсиялы). Дж. Уотсон мен Ф.Криктің жазған өз моделдеріне сәйкес, гендер бір-бірінен нуклеотидтер жұбы бойынша айырмашылығы болады, тұқым қуалаушылық ақпараты нуклеотидтер қатары арқылы кодталады және гендердің өзін-өзі өндіруі ДНҚ құрылысындағы негіздердің комплементарлық қаситі арқылы жүзеге асады. 1957 жылы М. Дельбрук мен Г. Стент бактерия клеткаларында Ж. Уотсон мен Ф. Криктің жартылай консервативті жолмен өзін-өзі өндіру –ДНҚ репликациясы туралы көзқарастарын мақұлдады.

Г. Стент эукариот клеткаларында ДНҚ репликациясының үш альтернативті гипотезасын тұжырымдады: 1) консервативтік; 2) жартылай консервативтік;3) дисперсиялық (дисперсиондық).

1. Консервативтік репликация. Ата-аналық (бастапқы) қостізбекті ДНҚ молекуласы тіпті жаңадан түзілетін қостізбекті молекуланың түзілуіне матрица қызметін атқарады. Бұл жерде жаңа клетканың біреуі бастапқы ДНҚ алса, екіншісі –қайта синтезделген ДНҚ молекуласын алады.

2. Жартылай консервативтік репликация. Бастапқы ДНҚ молекуласының екі тізбегі сырт киімнің алдындағы молния замогы сияқты екі жарты бөлікке бөлінеді. Содан кейін екі тізбектің әрқайсысы жаңа тізбектің түзілуі үшін матрицалық қызмет атқарады, негіздердің арасындағы сутектік байланыстар жаңа тізбек пен ескі тізбекті байланыстырып, бір тұтас молекула пайда болады. Жаңа клетка ДНҚ гибридтік молекуласын алады, ол бір ескі, бір жаңа тізбектерден құралаған. Нәтижесінде хромосома қос хроматидтен тұрады.

3. Дисперсиялық репликация. Бастапқы молекуланың материалы ортақ жас клеткаларға бөлінеді. Яғни, екі жаңа қос спиралдың фрагменттерін түзуге матрица қызметін атқаратын бастапқы ДНҚ қысқа әртүрлі ұзындықтардағы фрагменттерге бөлінеді, содан кейін белгісіз жолмен олар бір-бірімен қайта бірігеді

2. Мезельсон мен Стальдің жартылай консервативтік репликация туралы дәлелдемесі. М.Мезельсон мен Ф.Сталь хлорлы цезийдің тығыздығы градиентіндегі тең салмақты ультрацентрифугілеу мен радиоавтография тәсілімен жартылай консервативтік репликация барлық эукариот түрлеріне және көптеген прокариоттарға тән екндігін дәлелдеген. Тек вирустардың кейбір формалары репликацияның дисперсиялық және консервативтік жолдарымен көбейе алады.

3. Современные представления о механизмах репликации. Особенности действия ферментов репликации. Процесс репликации ДНК весьма сложен, но протекает аналогично у про- и эукариот, отличаясь участвующим ферментам, скоростью и направлением репликации, количеством точек репликации (числом репликативных вилок-репликонов).

Скорость репликации у эукариот осуществляется довольно медленно — 50 пар оснований в 1 с, а у Е.coli — 1700 пар/с, но малая скорость репликации компенсируется множеством репликонов и двунаправленностью репликации.

Начало синтеза ДНК — инициацию репликации — осуществляет РНК-полимераза, кодируемая геном dnaG. ДНК-полимераза в качестве затравки при репликации бактериальной ДНК использует полирибонуклеотид, синтезируемой на матрице ДНК. Эти короткие (около 10 звеньев) молекулы РНК в дальнейшем — в ходе роста цепи (элонгации) - удаляет ДНК-полимераза I, кроме полимеразой активности в направлении 5‘—3' растущей цепи этот фермент обладает 5‘—3‘-экзонуклеазной активностью, то есть способна отщеплять нуклеотиды с 5 ‘-конца. Таким образом, благодаря объединению этих двух активностей в одной молекуле фермента ДНК-полимераза I удаляет РНК-праймер и одновременно заполняет однонитевую брешь, полимеризуя дезоксирибонуклеотиды. Третья активность ДНК-полимеразы I — 3‘—5 ‘-экзонуклеотидная, которая осуществляет корректорские функции, удаляя ошибочно включенные в ДНК основания.

ДНК-полимераза I была открыта в 1956 г. А. Корнбергом (отцом) и его коллегами из Стэндфордского университета. Позже Т. Корнберг (сын) и другие, применяя генетические методы, выделили еще два фермента: ДНК-полимеразу II и ДНК-полимеразу III. Они обладают 5‘—3‘-полимеразной активностью, проявляют способность отщеплять нуклеотиды в этом направлении. Последние обеспечивают высокую точность репликации.

Для процесса репликации важны и топоизомеразы — ферменты, катализирующие переходы в молекулах ДНК, связанные с изменением степени сверхспирализации ДНК. Супервитки необходимо раскрутить, ДНК разделить и удерживать комплементарные цепи в расправленном состоянии.

Сбрасывание супервитков, возникающих при репликации из-за раскручивания двойной спирали, обеспечивает ДНК-гираза, относящаяся к классу топоизомераз. То есть для процесса инициации репликации, описанного выше, необходимы локальная денатурация и плавление ДНК.

Начало репликации — образование положительных свертков, возникающих при репликации из-за раскручивания двойной спирали. Этот процесс реализуется в присутствии ДНК-гиразы и АТФ. Сверхспирали (сверх-нитки) регулируют активность ДНК, а степень сверхспирализации контролируется гиразами. Инициирующее начало репликации сверхспиралей раскручивается топоизомеразой — хеликазой — особый класс белков, связывающихся с ДНК, удерживает нити ДНК разделенными. Это белки, дестабилизирующие двойную спираль. Благодаря действию всех этих белков на ДНК образуется участок локальной денатурации и две «вилки», в которых в дальнейшем и происходит репликация.

Поскольку ДНК-полимеразы катализируют репликацию только в направлении 5’—3’, а цепи родительской ДНК антипараллельны, только одна из новых цепей синтезируется непрерывно. Эта цепь называется лидирующей.

Вторая цепь называется отстающей и синтезируется в виде фрагментов ДНК — фрагментов Оказаки. Эти фрагменты, состоящие из 1000—2000 нуклеотидов (по Р. Оказаки), соответствуют коротким участкам репликации второй комплементарной цепи. Синтез каждого фрагмента Оказаки (3’- 5’) начинается на маленьком фрагменте РНК (около 10 нуклеотидов), который и есть затравка (праймер) для роста полидезоксирибонуклеотида. После удаления РНК и заполнения бреши с помощью ДНК-полимеразы I фрагменты соединяются ковалентно, действуя как 3‘—5‘экзонуклеаза. Соединение же обеспечивает ДНК-лигаза, замыкающая фосфодиэфирные связи.

Репарация ДНК. В любой клетке человека под влиянием различных факторов в ДНК ежедневно происходят тысячи случайных изменений, а за год в каждой клетке накапливается лишь очень небольшое число стабильных изменений нуклеотидной последовательности ДНК. Среди множественных и случайных замен оснований в ДНК лишь одна на тысячу приводит к возникновению мутации. Все остальные повреждения очень эффективно ликвидируются в процессе репарации ДНК.

Основной путь репарации включает три этапа:

– измененный участок поврежденной цепи ДНК распознается и удаляется с помощью ДНК-репарирующих нуклеаз. В спирали ДНК в этом месте возникает брешь;

– ДНК-полимераза и гликозилазы заполняют эту брешь, присоединяя нуклеотиды один за другим, копируя информацию с целостной нити;

– ДНК-лигаза «сшивает» разрывы и завершает восстановление молекулы.

 

4. Функции и строения ДНК-полимераз. Комплементарное копирование одноцепочечной матрицы катализируют ДНК—зависимые ДНК—полимеразы или просто ДНК-полимеразы. Некоторые про- и эукариотические ДНК-полимеразы получены в чистом виде, охарактеризованы их физические и ферментативные свойства. И хотя эти свойства не совсем идентичны, механизм их катализа для всех указанных ферментов в общих чертах одинаков.

Полимеризация нуклеотидов в процессе репликации происходит только в одном направлении: от 5’-конца к 3’-концу строящейся цепи, и синтезированная полинуклеотидная цепь ДНК антипараллельна по отношению к ДНК—матрице.

ДНК-полимеразы безразличны к последовательности нуклеотидов матрицы. Нормальное размножение клеток требует высокой точности копирования ДНК—матрицы, для чего существуют специальные механизмы коррекции. ДНК—полимеразы проверяют комплементарность каждого нуклеотида матрицы дважды: один раз — перед включением его в состав растущей цепи, во второй раз — перед тем, как включить следующий нуклеотид.

ДНК-полимеразы прокариот более изучены, чем полимеразы эукариот. Рассмотрим их на примере полимераз генома E.coli.

ДНК-полимеразы прокариот. ДНК-полимераза I была выделена А. Корнбергом и сотр. в 1958 г. Это одиночный полипептид (мол. масса 109 000 Да) с мультифункциональными активностями, хорошо связывается с одноцепочечной ДНК или с зонами разрыва фосфодиэфирных связей в биспиральной ДНК. Она обладает ДНК—полимеразной активностью, а также осуществляет гидролиз фосфодиэфирных связей как в одной цепи ДНК, так и на неспаренном конце дуплексной ДНК, причем за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3’-конца цепи (3’ —5’-экзонуклеаза).

Вторая реакция также состоит в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз начинается с 5’-конца дуплексной ДНК в направлении к 3’-концу (5’—3’-экзонуклеаза). Эти различные активности присущи разным сайтам полипептидной цепи ДНК-полимеразы I. При обработке фермента трипсином полипептидная цепь расщепляется на большой и малый фрагменты. Большой, С-концевой фрагмент («фрагмент Кленова») сохраняет ДНК-полимеразную и 3’-5’-экзонуклеазную активности; малый, N-концевой фрагмент обладает только 5’ —3’-экзонуклеазной активностью.

Экзонуклеазная активность 3’-5’ обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем ДНК-полимеразу I, то при репликации генома часто происходят мутации — замены оснований. Экзонуклеазная активность 5’ —3’ осуществляет разрушение праймера, необходимого для синтеза фрагментов Оказаки

ДНК-полимераза II (мол. масса 90 кДа) представлена одной полипептидной цепью, обладающей полимеразной и 3’ — 5’-экзонуклеазной активностями. Она плохо соединяется с одноцепочечной ДНК, но лучше работает с биспиральной ДНК, имеющей одноцепочечные бреши длиной в несколько десятков нуклеотидов, обладает лишь 10 %-й ДНК-полимеразной активностью по сравнению с ДНК-полимеразой I. Предполагают, что основной функцией ДНК-полимеразы II является достраивание поврежденных участков в молекуле ДНК, т.е. репарация ДНК.

ДНК-полимераза III (мол. масса 1000 кДа) — играет главную роль в репликации ДНК у Е.coli. В каждой клетке содержится только 10—20 копий фермента, приблизительно столько же, сколько репликативных вилок. ДНК-полимераза III является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в элонгации лидирующей цепи в вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки.

ДНК-полимераза III состоит из десяти типов субъединиц (α, β, γ, δ, δ', ε, θ, τ, χ, ψ). Репликацию проводит полная форма фермента — холофермент, содержащий все субъединицы. Холофермент не обладает 5’-3’-экзонуклеазной активностью, в связи с чем для репликации отстающей цепи необходимо участие ДНК - полимеразы I. Полимеразную реакцию осуществляет каталитический кор из 3 субъединиц, в котором α -субъединица обладает полимеразной активностью, ε -субъединица — 3’-5’-экзонуклеазной активностью. Помимо субъединиц, составляющих полимеразный кор, ДНК-полимераза - холофермент содержит еще семь субъединиц. Эти полипептиды существуют во множестве копий, являются регуляторными и усиливают действие каталитического ядра (кора) ДНК-полимеразы III.

ДНК-полимеразы эукариот. Более сложное строение генома эукариот предполагает участие в процессах репликации ДНК большего числа полимераз. Действительно, в реальном процессе репликации эукариот участвуют 6 различных ДНК-полимераз: α, β, γ, δ, ε, ζ.

ДНК-полимераза α – первая ДНК-полимераза, обнаруженная в клетках эукариот. Состоит из 3 субъединиц, одна из которых – наибольшая по размеру – непосредственно предназначена для синтеза праймеров, вторая отвечает за транспорт полимеразы в клеточное ядро, третья связывает пуриновый нуклеотид при сближении с цепью, а также присоединяет праймазу к ДНК-полимеразе. Она представлена в клетке в виде прочного комплекса с ДНК-праймазой - ферментом, осуществляющим синтез, осуществляющим синтез РНК-затравок. На богатых пиримидиновых участках матрицы праймаза комплекса синтезирует РНК-затравки длиной примерно 10 нуклеотидов, которые затем элонгируются ДНК-полимеразой без диссоциации комплекса от матрицы. В ходе репликации в клеточных ядрах ДНК-полимераза α-праймаза синтезирует затравку лидирующей цепи в участке ori и затравки фрагментов Оказаки запаздывающей цепи.

ДНК-полимераза β – наименьшая по размеру и самая простая по строению ДНК-полимераза в клетках эукариот. Основная функция в клетке связана с эксцизионной репарацией ядерной ДНК. Участвует в рекомбинации, в процессинге фрагментов Оказаки.

ДНК-полимераза δ - гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы (125— 130 кДа) и субъединицы весом 48 - 55 кДа, необходимой для преодоления ферментом структурных барьеров в природных однонитевых матрицах и для связи с фактором процессивности РСNА. Обе ферментативные активности ДНК-полимеразная и 3’---> 5’-экзонуклеазная — связаны с высокомолекулярным полипептидом. Кроме фактора, в присутствии которого процессивность этого фермента увеличивается на два порядка, холофермент включает в себя факторы RFC и RPA. Три молекулы РСNА образуют кольцевой тример с отверстием для двунитевой ДНК в центральной части, который представляет собой перемещающуюся по ДНК подвижную платформу или «скользящую скрепку» в форме тора (бублика), удерживающую ДНК-полимеразу δ в ходе полимеризации на матрице и обеспечивающую высокопроцессивный синтез ДНК.

ДНК-полимераза γ локализована в митохондриях, ее функция связана с репликацией и репарацией митохондриальной ДНК, она кодируется ядерным геномом. ДНК-полимераза γспособна направлять высокопроцессивную полимеризацию на однонитевых ДНК-матрицах в отсутствие вспомогательных факторов.

ДНК-полимераза ε осуществляет синтез отстающей цепи геномной ДНК в репликативной вилке, хотя ее функцию часто берет на себя ДНК-полимераза δ.

 

 

Контрольные вопросы.

1. Каков биологический смысл того факта, что сахарно-фосфатные остовы двойной спирали скреплены ковалентными связями, а поперечные мостики между ее двумя цепями образованы за счет водородных связей?

2. Каким образом эксперимент М. Мезельсона и Ф. Сталя позволяет различить дисперсный и полуконсервативный механизмы репликации ДНК?

3. Что служит затравкой при репликации ДНК в клетке?

4. Сколько типов ДНК-полимераз содержится в клетке кишечной палочки?

5. Расскажите, как осуществляется полуконсервативная репликация.

6. В чем биологический смысл каждого вида репликации ДНК и для каких организмов они свойственны?

7. Энзимология репликации ДНК.

8. Что такое фрагменты Оказаки?

9.Опишите механизм репарации.

10. Почему приходится ограничивать дозу рентгеновских лучей, получаемую человеком в течение определенного периода времени? Какие органы нуждаются в особо надежной защите от облучения?

 

Литература.

Основная

1. Коничев А.С, Севастьянова Г.А. Молекулярная биология. – М.: ACADEMA, 2005.

2. Аношкина Е.В., Кондратенко Е.И., Ломтева Н.А. Молекулярная биология. - Астраханский ун-т, 2007.

3. Грин, Н. Биология: в 3 т. / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. — М.: Мир,1990.

4. Инге-Вечтомов, С. Г. Генетика с основами селекции / С. Г. Инге-Вечтомов. — М.: Высшая школа, 1989.

5. Кемп, П. Введение в биологию / П. Кемп, К. Армс. М.: Мир, 1988.

6. Приходченко, Н. Н. Основы генетики человека / н. н. Приходченко, Т. П. Шкурат. — Ростов н/Д.: Феникс, 1997.

Дополнительная

1. Стент, Г. Молекулярная генетика: пер. с англ. / Г. Стент. — М., 1974.

2. Альбертс, Б. Молекулярная биология клетки: в 5 т. / Б. Альбертс, Д. Брей, М. Рефор, К. Робертс, Дж. Уотсон. —М.: Мир, 1986.

7. Мусил, Я. Современная биохимия в схемах / Я. Мусил и др. — М.: Мир, 1981.