(фермент ______в норме выделяется из клетки), которую транспортировали в
Бактерию. Сконструированная плазмида, как оказалось, содержала ин-
Формацию о структуре проинсулина, а не препроинсулина. При трансля-
Ции мРНК в клетках E. coli синтезировался гибридный белок, содержащий
Последовательности пенициллиназы и проинсулина. Гормон из этого бел-
Ка выщепляли трипсином. Было доказано, что полученный таким образом
Белок влияет на сахарный обмен аналогично гормону поджелудочной же-
Лезы. В 1979 г. в США в течение трех месяцев синтезировали гены, коди-
Рующие А- и В-цепи инсулина; гены были собраны из 18 и 11 олигонук-
Леотидов соответственно. Далее гены были встроены, как и при получении
соматостатина, в плазмиду в конце гена β-галактозидазы кишечной палочки.
В клетках E. coli также осуществлен синтез проинсулина, а не только
Его отдельных цепей. На выделенной матричной мРНК синтезировали
ДНК-копию. Синтез проинсулина имеет определенные преимущества, так
Как процедуры экстракции и очистки гормона минимальны.
Совершенствование техники получения генноинженерных штаммов-
Продуцентов с помощью различных приемов (амплификацией плазмид,
Инкапсулированием вводимых рекомбинантных ДНК, подавлением про-
Теолитической активности реципиентных клеток) позволило получить
высокие выходы гормона, до 200 мг/л культуры. Медико-биологические и
Клинические испытания генноинженерного белка показали пригодность
Препарата, и в 1982 г. он был допущен к производству во многих странах.
а
б
в
г
Pst
Pst
Pst
Ген устойчивости
К тетрациклину
Ген устойчивости
К тетрациклину
Ген
Пенициллиназы
Ген
Пенициллиназы
Пенициллиназа
Ген
Проинсулина
Проинсулин
Инсулин
Рис. 4.3. Биосинтез инсулина крысы в сконструированных клетках E. coli
(по Gilbert e.a., 1980).
а) карта плазмиды pBR322 c двумя генами – пенициллиназы и устойчивости к тетрациклину;
Б) карта, полученная при определении последовательности кДНК рекомбинантной плазмиды
В продуцирующем инсулин клоне E. coli; в) гибридный белок; г) биологически активный инсулин
После удаления пенициллиназы и сегмента проинсулина.
Биосинтез соматотропина
Соматотропин (гипофизарный гормон роста) впервые был выделен в
Г. из трупного материала. Выход гормона из одного гипофиза со-
ставлял около 4–6 мг в пересчете на готовый фармацевтический препарат.
Для лечения карликовости необходимая доза составляет 6 мг в неделю в
Течение года. Кроме недостатка по массе, получаемый экстракцией препа-
Рат был гетерогенным, против него вырабатывались антитела, которые
Сводили на нет действие гормона. Более того, существовала опасность,
Синтетические
Олигодезоксинуклеотиды
(12 фрагментов)
Гипофиз
Человека
Лигаза
Лигаза
Лигаза
Рекомбинантная
Плазмида
С геном ГРЧ
Экспрессирующий
Вектор
PBR322
Регуляторная область lac
Липкий конец Тупой конец
МРНК
Сверхразмерная кДНК ГРЧ
Обратная
Транскриптаза
Рестрикционная
Лигаза эндонуклеаза
Очистка и монтаж Очистка
Фрагмента
ATG ГРЧ 1-24 ГРЧ кДНК 25-191
Регуляторная область lac
PBR322
Рис. 4.4. Схема конструирования гена соматотропина комбинацией химического синтеза
И выделения природной мРНК (по P. Newmark, 1979).
Что при получении препарата могло произойти заражение организма мед-
Ленно развивающими вирусами. Поэтому дети, получавшие данный пре-
Парат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.
Генноинженерный препарат имеет несомненные преимущества: досту-
Пен в больших количествах, гомогенен, не содержит вирусов. Синтез сома-
Тотропина, состоящего из 191 аминокислотного остатка, был осуществлен в
США Гедделем с сотрудниками в 1979 г. (компания «Генентек») (рис. 4.4).
При химико-ферментном синтезе ДНК получается ген, кодирующий
Предшественник соматотропина, поэтому был выбран специальный путь
