Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществля-

ется в составе вектора. Вектор – это, как правило, кольцевая молекула

ДНК, способная к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором

Образует рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК

При обычном введении в бактериальную клетку ДНК подвергается

Ферментативной атаке, в результате которой разрушается. Чтобы этого не

Происходило, используют векторные молекулы ДНК, способные при вве-

дении в клетку существовать автономно, а при делениях клетки – репли-

Цироваться. Вектор также несет в своем составе генетический признак,

Необходимый для последующего распознавания и отбора трансгенных

Организмов. Обычно в качестве маркерных генов используют гены устой-

Чивости к антибиотикам.

Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro с изо-

Лированными ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции, которые расще-

Пляют вектор в одном участке, превращая его из кольцевой формы в ли-

Нейную с образованием липких концов, комплиментарных концам вводи-

Мой ДНК. Комплиментарные концы вектора и вводимого гена сшиваются

Лигазой. Полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-

Лигазы замыкают с образованием кольцевой молекулы.

В качестве векторов используют плазмиды и вирусы. Вирусы быстро

Транспортируются из клетки в клетку, за короткое время способны быстро

Заразить весь организм. Важной проблемой при их использовании являет-

ся аттеньюация – ослабление патогенности для хозяина; таким образом, не

Очевидно, что зараженные вирусом клетки выживут и смогут передавать

Потомству измененную генетическую программу. Наиболее распростра-

Ненными векторами являются многокопийные плазмиды с молекулярной

массой 3–10 кб. Первые плазмиды были выделены из бактерий, впослед-

Ствии их стали конструировать методами генной инженерии.

Использование векторов общего назначения методически – несложная

Задача, не требующая специального оборудования. Наиболее используе-

Мыми плазмидными векторами для клонирования являются плазмиды E.

Coli (pBR322, pBR325, pACYC117, pACYC 184), а также сконструирован-

Ные на основе плазмиды CoIEI. Современные плазмидные векторы в при-

Сутствии хлорамфеникола способны к репликации, независимо от деления

хромосомы, количество копий плазмид при этом может возрастать до 1–

Копий на клетку.

При получении библиотеки генов растений и высших животных, у ко-

торых общая длина генома составляет до 3⋅109 и более, емкость вектора

Часто играет решающую роль. В данном случае в качестве вектора ис-

пользуют ДНК фага λ. При помощи специальных методов рекомбинант-

Ные ДНК вводят прямо в фаговые головки. Еще большей емкостью обла-

дают плазмиды – космиды (до 40 кб), у которых cos-фрагмент генома фага

λ, участвует в упаковке ДНК в фаговую частицу на конечной стадии раз-

Вития. Для упаковки ДНК необходимо, чтобы ДНК содержала COS-

Участок и ее размер был примерно равным размеру генома ага l. Достиг-

Нутые методы упаковки ДНК в фаговую головку при помощи космид по-

Зволяют получать библиотеки генов практически любых организмов.

Перенос генов в клетки организма-реципиента

Перенос рекомбинантных ДНК осуществляется путем трансформа-

ции или конъюгации. Трансформация – это процесс изменения генетиче-

Ских свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК.

Впервые она была обнаружена у пневмококков Ф. Гиффитом, который

Показал, что некоторые клетки невирулентных штаммов бактерий при

Заражении ими мышей совместно с вирулентными штаммами приобрета-

Ют патогенные свойства. В дальнейшем трансформация была продемонст-

Рирована и изучена у различных видов бактерий.

Установлено, что к трансформации способны лишь некоторые, так

называемые «компетентные», клетки (способные включать чужеродную