По закінченню періоду трансфекції культури переносили на лід, повністю відбирали середовище, прибирали залишки середовища промивкою 1х PBS (136 mM NaCl, 2,7 mM KСl, 8 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, pH 7,5) та додавали 1 мл буферу для лізису T2GN50 (рН 7,5), що містив 20 mM Tris-HCl, 50 мМ NaCl, 0,5% Triton X-100, 5 % гліцеролу, 10 мМ бета-меркоптоетанол, інгібітори протеаз у концентрації 10 mM бензамідин та 1 mM пефаблок. Клітинну суспензію перемішували вортексуванням та осаджували нерозчинну фракцію центрифугуванням протягом 15 хвилин при швидкості 14,000 об/хв за температури +40С. Надосадову фракцію відбирали та 1 годину інкубували із 20 мкл афінного гелю Anti-Flag M2, що містить антитіла до мітки Flag, переміщуючи на вертикальному ротароті при +40С. Після інкубації матрикс із адгезованими білками осаджували центрифугуванням при швидкості 14,000 об/хв 2 хвилини. До 40 мкл супернатанту додавали 40 мкл буферу SBL 2х (100 mM Tris-Cl (pH 6.8), 200 mM дитіотреїтол, 4% натрію додецилсульфат, 0.2% бром феноловий синій, 20% гліцеролl) та 3 хвилини кип’ятили при 950С, підготовлений зразок тотального екстракту фракції розчинних білків використовували для подальшого аналізу. Афінний матрикс осаджували центрифугуванням при 14,000 об/хв протягом 1 хвилини при +40С та відбирали супернатант, з якого готували зразок незв’язаної фракції білків за умовами, описаними вище. Матрикс після інкубації промивали 500 мкл буферу WB50+ (20 мМ Tris-HCl (pH7,5), 50 мМ NaCl, 5% гліцерол та 10 мМ бетамеркаптоетанол) 5 разів та ресуспендували у 50 мкл цього ж буферу. До суміші додавали 10 мкг Flag-пептиду та інкубували протягом 1 години при +40С, перемішуючи осівший матрикс кожні 5-10 хвилин. Суміш після інкубації осаджували 2 хвилини при 14,000 об/хв за температури +40С. Відбирали супернатант без домішок афінного гелю, до 30 мкл додавали 10 мкл буферу SBL у кінцевій концентрації 1х та 3 хвилини кип’ятили при 950С.
Вестерн-блот аналіз
На першому етапі Вестерн-блот аналізу проводили електрофорез у ПААГ за стандартною методикою [47] з використанням системи Bio-Rad (поліакриламідні гелі для аналізу білків Any kD MiniPROTEAN TGX Gel та концентрований трис-гліциновий буфер, у який перед використанням додавали SDS у кінцевій концентрації 0,3%). Кількість білків розчинної фракції та фракції, яка не зв’язалась із афінним матриксом, нанесених на гель була однаковою. Аліквота у 15 мкл кожного зразка попередньо наносилась на гель та аналізувалась за допомогою системи візуалізації поліакрамідних гелів Gel Doc EZ System (BioRad). Кількість білків порівнювалась відповідно до інтенсивності сигналу флуоресценції триптофану з використанням програмного забезпечення Image Lab. Після цього підбиралися оптимальні об’єми зразків так, щоб вони містили однакову кількість білків. Всередньому об’єм зразків складав 5 мкл чистого екстракту у буфері для нанесення. Для аналізу фракції білків, елюйованих із афінного матриксу 11,25 мкл елюату використовували для перевірки наявності аміноацил-тРНК-синтетаз, а 3 мкл - для перевірки NPRL2. Таким чином, було визначено об’єми екстрактів, що містили однакову кількість білків для подальшого проведення Вестерн-блот аналізу. Окрім цього, в кожному експерименті вміст нанесеного на гель препарату білка перевірялась додатково з використанням вищезгаданої системи візуалізації гелів.
Після проведення електрофорезу, білки переносили на нітроцелюлозну мембрану. Для цього використовували набір для переносу білків на нітроцелюлозну мембрану TransBlot Turbo Nitrocellulose Transfer Packs (BioRad) та систему для напівсухого переносу білків на мембрану Trans Blot Turbo Transfer Starter System (BioRad) зі стандартними умовами 25 V, 2,5 A протягом 7 хв. Після переносу нітроцелюлозні мембрани швидко поміщали у буфер TBS-T (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.6) та перевіряли його якість за допомогою системи Gel Doc EZ System (BioRad). Перенос з гелів, що містили білкові фракції одного експерименту, на мембрани проводили одночасно.
Для проведення інкубацій нітроцелюлозної мембрани з розчинами, що містять первинні та вторинні антитіла використовували систему для Вестерн-блот аналізу Bench-Pro 4100 Card Processing Station (Invitrogen). Для цього готували відповідні буфери та програмували за стандарним протоколом:
· промивка — 2 хв — ТВS-T (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.6);
· блокування — 30 хв — блокуючий розчин — 5% розчин знежиреного молока у 1х ТВS-T;
· промивка — 2 хв — ТВS-T;
· інкубація з первинними антитілами, що мають афінітет до Flag-мітки, обраних АРСаз та білка р43 — 60 хв — розчин первинних антитіл у блокуючому розчині;
· промивка — 5 хв, 5 хв, 5 хв, 2 хв — ТВS-T;
· інкубація із вторинними антитілами проти антитіл миші та кроля— 30 хв — розчин вторинних антитіл у блокуючому розчині;
· промивка — 5 хв, 5 хв, 5 хв, 2 хв — ТВS-T.
Первинні антитіла миші та кроля розводили у блокуючому розчині і використовували у таких концентраціях: AntiFLAG M2 (SigmaAldrich, США) — 1/1,000; AntiR3 CHO_3pur — 1/1,000; IgG MTS-T 14/04/85 — 1/50,000; IgG1 Gln-DEAE 14/04/85 — 1/1,000; IgG anti cKRS DN lapin 117 25/04/02 — 1/1,000; IgG AspRS DN20 13/12/96 — 1/2,000; IgG anti human p43 Ct lapin 052 30/05/00 — 1/1,000.
Вторинні антитіла проти антитіл миші, кон’юговані пероксидазою хрону використовували у розведенні 1/2,000, а вторинні антитіла проти антитіл кроля, кон’юговані пероксидазою хрону — у 1/3,000.
