ТЕМА 2. ФЕРМЕНТИ
1. Швидкість хімічних реакцій. Сутність явища каталізу. Особливості ферментативного каталізу.
2.Класифікація й номенклатура ферментів. Хімічна природа ферментів, їхні функціональні групи. Активний й алостеричний центри. Коферменти, простетичні групи. Роль вітамінів, металів й інших кофакторів у функціонуванні ферментів. Множинні форми ферментів.
3.Загальні уявлення про кінетику й механізм ферментативних процесів. Специфічність дії ферментів. Вплив різних факторів середовища на ферментативні процеси (температури, концентрації водневих іонів й ін.). Активатори та інгібітори. Локалізація ферментів у клітині.
1. Швидкість хімічних реакцій. Сутність явища каталізу. Особливості ферментативного каталізу.
Швидкість хімічних реакцій
швидкість реакції визначається як зміна концентрації реагуючих речовин, що відбувається за одиницю часу. Швидкість реакції залежить від будови молекул реагуючих речовин, їхньої концентрації, температури, тиску, наявності каталізаторів і деяких інших факторів.
Сутність явища каталізу.
Реакція стає можливою тільки при зіткненнях молекул. Чим більше молекул в одиниці об'єму, тим частіше вони зіштовхуються одна з одною, тим швидше перетворяться. Однак, не кожне зіткнення реагуючих молекул приводить до їхньої зміни. Щоб реакція почалася, молекули повинні мати певний запас енергії, необхідним для подолання енергетичного бар'єра, що створюється міжмолекулярними силами відштовхування й внутрішньомолекулярними силами зчеплення (міцністю хімічних зв'язків). Особливо багато енергії потрібно для розриву ковалентних зв'язків, що переважають у молекулах органічних речовин. Коли енергетичний бар'єр переборений і реакція почалася, у ході її може виділитися значно більше енергії, чим витрачено на початок процесу. Зміни енергії, що відбуває в ході хімічних реакцій може бути зображене графічно. Кількість енергії, необхідна грам-молекулі реагуючої речовини для вступу в реакцію, називається енергією активації й розраховується в Кдж/моль.
Чим більше в речовині активних (збуджених) молекул, здатних перебороти енергетичний бар'єр, тим вище швидкість його хімічних перетворень. У звичайних умовах тільки незначна частина молекул речовини перебуває в активному стані. Активація їх відбувається при збільшенні температури, концентрації реагуючих речовин, збільшенні тиску (якщо це газоподібні речовини).
У живих організмах великі коливання температури й тиску неможливі, тому більшість хімічних реакцій у живих організмах іде за участю ферментів (або біологічних каталізаторів), які знижують енергію активації реагуючих молекул у багато разів за рахунок зменшення сил відштовхування між молекулами й ослаблення внутрішньомолекулярних зв'язків
Поняття ферменту
Ферменти (від лат. fermentum - шумування, закваска) - це специфічні білки, що є присутніми у всіх живих клітинах де відіграють роль біологічних каталізаторів, тобто прискорюють протікання хімічних реакцій в організмі. Через їхнє посередництво реалізується генетична інформація й здійснюються всі процеси обміну речовин й енергії в живих організмах.
У цей час відомо більше 2000 різних ферментів, з яких багато хто виділені з живих кліток й отримані в індивідуальному стані. Перший кристалічний фермент (уреаза) виділений американським біохіміком Д.Самнером в 1926 р. Для ряду ферментів вивчена послідовність амінокислот і з'ясоване розташування поліпептидних ланцюгів у тривимірному просторі. У лабораторних умовах здійснений штучний хімічний синтез ферменту рибонуклеази.
Діючи в строго певному порядку, ферменти каталізують сотні реакцій, у ході яких розщеплюються молекули поживних речовин, запасається й перетвориться енергія й з молекул - попередників будуються макромолекули, що входять до складу клітини.
Завдяки тонкій координованості між всіма ферментативними реакціями дотримується гармонійна рівновага всіх метаболічних процесів і забезпечується нормальне функціонування живих організмів.
Так, деякі хвороби пов'язані з недостатністю або повною відсутністю деяких ферментів або, навпроти, з надмірністю дії того або іншого ферменту. Вимірюючи активність ферментів у плазмі крові можна діагностувати багато захворювань й оцінювати функціональний стан у спортсменів. У цей час ферменти широко використовуються в медицині (наприклад, травні ферменти у вигляді лікарських препаратів Панзинорм, Фестал і т.д.), у харчовій промисловості (наприклад, амілаза використовується при виробництві морозива, протеаза - при виготовленні ковбас і м'ясних консервів, у хімічній промисловості при виробництві зубних паст використовується каталаза, пральних порошків - амілаза, ліпаза, крім того, амілаза використовується при виготовленні паперу, бавовни, при виробленні шкір).
Особливості ферментативного каталізу.
· Швидкість хімічних реакцій прискорюється ферментами в 106 -1016 разів, у порівнянні з хімічними каталізаторами.
· Ферменти працюють при нормальній температурі тіла (37-42°) і нормальному тиску
· Здійснюється тонка регуляція ферментативної реакції, немає відходів і шлаків.
· Ферментативні реакції підкоряються термодинамічній кінетиці.
· Ферменти не зміщають рівновагу реакції, а тільки прискорюють його наближення.
2. КЛАСИФІКАЦІЯ Й НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТІВ. ХІМІЧНА ПРИРОДА ФЕРМЕНТІВ, ЇХНІ ФУНКЦІОНАЛЬНІ ГРУПИ. КОФЕРМЕНТИ, ПРОСТЕТИЧНІ ГРУПИ. РОЛЬ ВІТАМІНІВ, МЕТАЛІВ Й ІНШИХ КОФАКТОРІВ У ФУНКЦІОНУВАННІ ФЕРМЕНТІВ. АКТИВНИЙ Й АЛОСТЕРИЧНИЙ ЦЕНТРИ. МНОЖИННІ ФОРМИ ФЕРМЕНТІВ.
Класифікація й номенклатура ферментів.
Ферментологія дуже довго не мала у своєму розпорядженні строго наукову номенклатуру ферментів. Найменування ферментам давали по випадкових ознаках (тривіальна номенклатура), за назвою субстрату (раціональна), по хімічному складі ферменту, нарешті, по типу реакції, що каталізується і характеру субстрату.
Прикладами тривіальної номенклатури можуть служити назви таких ферментів, як пепсин (від греч. пепсис - травлення), трипсин (від греч. трипсис - розріджую) і папаїн (від назви динячого дерева Carica papaja, із соку якого він виділений). По дії всі ці ферменти є протеолітичними, тобто прискорюють гідроліз протеїнів (білків). Характерна назва була дана групі забарвлених внутрішньоклітинних ферментів, що прискорюють окисно-відбудовні реакції в клітині, - цитохроми (від лат. citos - клітина і chroma - цвіт).
Найбільшого поширення одержала раціональна номенклатура, відповідно до якої назва ферменту складається з назви субстрату характерного закінчення -аза. Вона була запропонована більш сторіччя тому тому, у 1883 р. Э. Дюкло - учнем Л. Пастера. Так, фермент, що прискорює реакцію гідролізу крохмаля, одержав назву амілаза (від греч. амілон - крохмаль), гідроліза жирів - ліпаза (від греч. ліпос - жир), білків (протеїнів) - протеаза, сечовини - уреаза (від греч. уреа - мочевина) і т.п.
Коли методами аналітичної хімії були досягнуті відомі успіхи в розшифровуванні хімічної природи простетических груп, виникнула нова номенклатура ферментів. Їх стали іменувати за назвою простетичної групи, наприклад, гемінфермент (простетическая група - гем), піридоксаль-фермент (простетична група - піридоксаль) і т.п.
Потім у назві ферменту стали вказувати як на характер субстрату, так і на тип каталізуємої реакції.
У 1961 р. Международная комісія з номенклатури ферментів представила V Міжнародному біологічному конгресу проект номенклатури, побудований на строго наукових принципах. Проект був затверджений конгресом, і нова номенклатура міцно ввійшла у ферментологію. Відповідно до цього (Московської) номенклатурі назва ферментів складають із хімічної назви субстрату і назви тієї реакції, що здійснюється ферментом. Якщо хімічна реакція, що прискорюється ферментом, супроводжується переносом угруповання атомів від субстрату до акцептору, назва ферменту включає також хімічне найменування акцептора.
У зв'язку зі значним ускладненням наукових назв у новій номенклатурі припускається зберігання поряд із новими старих тривіальних, робітників назв ферментів. Міжнародною комісією був складений детальний список усіх відомих у той час ферменти, істотно доповнений у 1972 р. при перегляді як класифікації, так і номенклатури деяких ферментів, де поруч із новою науковою назвою кожного ферменту приведена стара, а також зазначено хімізм реакції ферменту й у деяких випадках природа ферменту. Таким чином, виключається можливість плутанини в найменуванні ферментів. У 1964 р. список уключав 874 ферменту; у наступний час він був істотно доповнений і зріс до 1770 ферментів у 1972 р. і до 2003 ферментів у 1979 р.
В основу класифікації ферментів був покладений тип реакції, що піддається каталітичному впливу. По цьому принципі всі ферменти ділять на 6 класів.
I. Оксидоредуктази
До класу оксидоредуктаз відносять ферменти, що каталізують реакції окислення - відновлення.
Трансферази
Прискорюють реакції переносу функціональних груп і молекулярних залишків від однієї сполуки до іншого. Це один з найбільш великих класів: він нараховує близько 500 індивідуальних ферментів. Залежно від характеру залишків розрізняють фосфотрансферази, амінотрансферази, глікозилтрансферази, ацилтрансферази, трансферази, метилтрансферази, формілтрансферази, і ін.
3. Гідролази
Прискорюють реакції гідролітичного розпаду ефірних, пептидних, глікозидних й ін. зв'язків у молекулах ліпідів, білків, вуглеводів, нуклеотидов. До гідролаз належать всі травні ферменти.
4. Ліази
Прискорюють негідролітичне відщіплення від субстратів певних груп атомів з утворенням подвійного зв'язку (або приєднують групи атомів по подвійному зв'язку):
Ізомерази
Прискорюють просторові або структурні перебудови в межах однієї молекули:
6. Лігази
Прискорюють реакції синтезу, спряжені з розпадом багатих енергією зв'язків.
Кожному ферменту в зазначеному списку привласнений індивідуальний номер (шифр). Наприклад, шифр уреаза виражається цифрами 3.5.1.5. Це означає, що уреаза відноситься до 3-го класу (перша цифра) ферментів, усі представники якого каталізуюті реакції гідролизу. Друга цифра (5) говорить про те, що уреаза належить до 5-го підкласу цього класу, куди зараховані усі ферменти, що прискорюють гідроліз С - N-зв'язків, що не є пептидними. Третя цифра шифру (1) указує на приналежність уреази до підпідкласу 5-го підкласу, члени якого прискорюють гідроліз лінійних амідів, а остання цифра (5) - порядковий номер уреази в цьому підпідкласі.
Таким чином, шифр абсолютно точно вказує місце ферменту в загальному списку. В даний час прийнято в наукових публікаціях при першому нагадуванні ферменту вказувати в скобках його шифр.
Хімічна природа ферментів, їхні функціональні групи.
Всі ферменти по хімічній природі є простими або складними білками з великою молекулярною масою (каталаза - 248000 Д, піруват- дегідрогеназа - 4500000 Д). При гідролізі утворюються амінокислоти й, так само як і білки чутливі до дії високих температур, випромінювання, солей важких металів, концентрованих кислот і лугів.
Ферменти можуть бути однокомпонентними, простими білками, що складаються тільки з амінокислот і двокомпонентними, складними білками. У другому випадку в складі ферменту виявляється додаткова група небілкової природи
Коферменти, простетичні групи. Роль вітамінів, металів й інших кофакторів у функціонуванні ферментів.
Найчастіше додаткову групу, міцно зв'язану, не відокремлювану від білкової частини (апоферменту), називають простетичною групою; на відміну від цього додаткову групу, що легко відокремлюється від апоферменту й здатна до самостійного існування, звичайно йменують коферментом.
Хімічна природа найважливіших коферментів була з'ясована в 30-і роки нашого сторіччя завдяки працям О. Варбурга, Р. Куна, П. Каррера й ін. Виявилося, що роль коферментів у двокомпонентних ферментах відіграють більшість вітамінів (Е, ДО, Q, В1, В2, В6, В12, З, Н и ін.) або сполук, побудованих за участю вітамінів (коензим А, НАД+ і т.п.). Крім того, функцію коферментів виконують такі сполуки, як НS-глутатіон, численна група нуклеотидів й їхніх похідних, фосфорні ефіри деяких моносахаридів і ряд інших речовин.
Характерною рисою двокомпонентних ферментів є те, що ні білкова частина, ні додаткова група окремо не мають помітну каталітичну активність. Тільки їхній комплекс проявляє ферментативні властивості. При цьому білок різко підвищує каталітичну активність додаткової групи, властиву їй у вільному стані в дуже малому ступені; додаткова ж група стабілізує білкову частину й робить її менш уразливої до денатуруючим агентів. Таким чином, хоча безпосереднім виконавцем каталітичної функції є простетична група, що утворює каталітичний центр, її дія не можлива без участі поліпептидних фрагментів білкової частини ферменту. Більш того, в апоферменті є ділянка, що характеризується специфічною структурою, вибірково єднальний кофермент. Це так званий коферментзв’язуючий домен; його структура в різних апоферментів, що з'єднуються з тим самим коферментом, дуже подібна. Такі, наприклад, просторові структури нуклеотидзв’язуючих доменів ряду дегідрогеназ.
Активний й алостеричний центри.
По-іншому полягає справа в однокомпонентних ферментів, що не мають додаткової групи, що могла б входити в безпосередній контакт із сполукою, що перетворюється. Цю функцію виконує частина білкової молекули, що називається каталітичним центром. Припускають, що каталітичний центр однокомпонентного ферменту являє собою унікальне сполучення декількох амінокислотних залишків, що розташовуються в визначеній частині білкової молекули.
Найчастіше в каталітичних центрах однокомпонентних ферментів зустрічаються залишки Сер, Гіс, Три,Арг, Цис, Асп, Глу й Тир. Радикали перерахованих амінокислот виконують тут ту ж функцію, що й кофермент у складі двокомпонентного ферменту.
Амінокислотні залишки, що утворюють каталітичний центр однокомпонентного ферменту, розташовані в різних точках єдиного поліпептидного ланцюга. Тому каталітичний центр виникає в той момент, коли білкова молекула набуває властиву їй третинну структуру. Отже, зміна третинної структури ферменту під впливом тих або інших чинників може призвести до деформації каталітичного центру і зміні ферментативної активності.
Крім каталітичного центра, утвореного сполученням амінокислотних радикалів або приєднанням коферменту, у ферментів розрізняють ще два центри: субстратний й алостеричний.
Під субстратним центром розуміють ділянку молекули ферменту, відповідальну за приєднання речовини (субстрату), що піддається ферментативному перетворенню. Часто цю ділянку називають 'якірною площадкою' ферменту, де, як судно на якір, стає субстрат. У багатьох випадках прикріплення субстрату до ферменту йде за рахунок взаємодії з ε -аміногрупою радикала лізину (Ліз), розташованого в субстратному центрі. Цю ж роль може виконувати СООН-група глутамінової кислоти (Глу), а також НS-група цистеїну (Цис). Проте роботи останніх років показали, що набагато більше значення тут мають сили гідрофобних взаємодій і водневі зв'язки, що виникають між радикалами амінокислотних залишків субстратного центру ферменту і відповідних угруповань у молекулі субстрату.
Поняття про каталітичний і субстратний центр не варто абсолютизувати. У реальних ферментах субстратний центр може збігатися (або перекриватися) із каталітичним центром. Більш того, каталітичний центр може остаточно формуватися в момент приєднання субстрату. Тому часто говорять про активний центр ферменту, що представляє собою сполучення першого і другого. Активний центр у ферментів розташовується на двох щілинах при двоядерній структурі, наприклад у лізоциму і рибонуклеази, або на дні глибокої западини, як у хімотрипсиногену.
Алостеричний центр являє собою ділянку молекули ферменту, у результаті приєднання до якої певної низькомолекулярної (а іноді - і високомолекулярної) речовини змінюється третинна структура білкової молекули. Внаслідок цього змінюється конфігурація активного центру, що супроводжується або збільшенням, або зниженням каталітичної активності ферменту. Це явище лежить в основі так званої алостеричної регуляції каталітичної активності ферментів.
Множинні форми ферментів.
Способи компонування протомерів у мультимери різноманітні. Вкрай важливо, що добудований із субодиниць фермент виявляє максимальну каталітичну активність саме у вигляді мультимеру: дисоціація на протомери різко знижує активність ферменту. Не усі ферменти-мультимери збудовані винятково з каталітично активних протомерів. Поряд із каталітичними в їхньому складі відзначені регуляторні субодиниці, як, наприклад, в аспартат-карбамілтрансферази.
Серед ферментів-мультимерів безумовно переважають димери і тетрамери (їх кілька сотень), у меншій мірі поширені гексамери й октамери (декілька десятків) і незвичайно рідко зустрічаються тримери і пентамери.
Молекули ферментів-мультимерів у ряді випадків складаються із субодиниць двох типів, що позначаються умовно як субодиниці типу А и В. Вони подібні одна з одною, але відрізняються по деяких деталях первинної і третинної структур. У залежності від співвідношення протомерів типу А и В у мультимері останній може існувати у вигляді декількох ізомерів, що називають ізозимами. Так, при чотирьох субодиницях можливі 5 ізозимів.
Зараз інтерес до ізозимів різко підвищився. Виявилося, що крім генетично детермінованих ізозимів існує велика група ферментів, що володіє множинними формами, що виникають у результаті їхній посттрансляційної модифікації. Множинні форми ферментів і ізозими зокрема використовуються зараз для діагностики хвороб у медицині, прогнозування продуктивності тварин, добору батьківських пар при скрещуванні для забезпечення максимального гетерозису в нащадку і т.п.
3. ЗАГАЛЬНІ УЯВЛЕННЯ ПРО КІНЕТИКУ І МЕХАНІЗМ ФЕРМЕНТАТИВНИХ ПРОЦЕСІВ. СПЕЦИФІЧНІСТЬ ДІЇ ФЕРМЕНТІВ. ВПЛИВ РІЗНИХ ФАКТОРІВ СЕРЕДОВИЩА НА ФЕРМЕНТАТИВНІ ПРОЦЕСИ (ТЕМПЕРАТУР, КОНЦЕНТРАЦІЇ ВОДНЕВИХ ІОНІВ І ІН.). АКТИВАТОРИ ТА ІНГІБІТОРИ. ЛОКАЛІЗАЦІЯ ФЕРМЕНТІВ У КЛІТИНІ.
Загальні уявлення про кінетику і механізм ферментативних процесів.
На першому етапі (I) відбувається активація ферменту шляхом зв'язування з алостеричним центром регуляторних речовин (наприклад, гормонів), що призводить до зміни конформації активного центру ферменту і збільшення його здатності зв'язувати молекулу субстрату.
На другому етапі (II) відбувається 'впізнавання' ферментом свого субстрату
На третьому етапі (III) відбувається формування неактивного фермент-субстратного комплексу за рахунок утворення гідрофобних і водневих зв'язків між радикалами амінокислотних залишків субстратного центру (контактні площадки) і відповідними групами в молекулі субстрату. Молекула субстрату утримується поблизу активного центру, але хімічним перетворенням ще не піддається.
На четвертому етапі (IV) утворюється активний фермент-субстратний комплекс. При цьому відбувається хімічне перетворення субстрату за участю каталітичного центру і коферменту (якщо мова йде про складний фермент). У результаті цього молекула субстрату змінює свою просторову конфігурацію, у ній відбувається перерозподіл енергії і зменшується міцність зв'язків.
На п'ятому етапі (V) фермент-субстратний комплекс стає нестабільним і потім перетворюється в комплекс фермент-продукт, що розпадається на продукти реакції і фермент. Фермент із реакції виходить у незмінному вигляді.
Специфічність дії ферментів.
Абсолютна специфічність
Абсолютно специфічні ферменти прискорюють певний тип реакції одного єдиного субстрату. Так, аргіназа каталізує тільки реакцію гідролізу аргініну на орнітин і сечовину; сахараза - гідроліз сахарози на глюкозу і фруктозу.
Особливим видом абсолютної специфічності є стереоспецифічність, тобто спроможність прискорювати перетворення тільки одного стереоізомеру речовини.
Відносна Відносна специфічність
Ферменти, що володіють відносною специфічністю, прискорюють реакції, характерні для певних типів хімічних зв'язків у молекулах різноманітних речовин одного класу. Наприклад, стравоварильний фермент пепсин прискорює гідроліз пептидних зв'язків, утворених при участі циклічних амінокислот, у будь-яких білках; ліпаза - гідроліз складноефірних зв'язків гліцеридів, утворених будь-якими жирними кислотами.
По образному виразові, нерідко уживаному в біохімічній літературі, фермент підходить до субстрату, як ключ до замка. Це знамените правило було сформульовано Э. Фішером у 1894 р. виходячи з того, що специфічність дії ферменту визначається суворою відповідністю геометричної структури субстрату й активного центру ферменту.
У 50-е роки нашого сторіччя це статичне уявлення було замінено гіпотезою Д. Кошланда про індуковану відповідність субстрату і ферменту. Сутність її зводиться до того, що просторова відповідність структури субстрату й активного центру ферменту створюється в момент їхньої взаємодії один з одним, що може бути виражено формулою "рукавичка - рука". При цьому в субстраті вже деформуються деякі валентні зв'язки і він, таким чином, підготовлюється до подальшої каталітичної видозміни, а в молекулі ферменту відбуваються конформаційні перебудови. Гіпотеза Кошланда, заснована на допущенні гнучкості активного центру ферменту, задовільно пояснювала активування й інгібування дії ферментів і регуляцію їхньої активності при впливі різноманітних чинників. Зокрема, конформаційні перебудови у ферменті в процесі зміни його активності Кошланд порівнював із коливаннями павутиння, коли в неї потрапила здобич (субстрат), підкреслюючи цим крайню лабільність структури ферменту в процесі каталітичного акту:
В даний час гіпотеза Кошланда поступово витісняється гіпотезою топохімічної відповідності. Зберігаючи основні положення гіпотези взаємоіндукованого настроювання субстрату і ферменту, вона фіксує увагу на тому, що специфічність дії ферментів пояснюється в першу чергу впізнаванням тієї частини субстрату, що не змінюється при каталізі. Між цією частиною субстрату і субстратним центром ферменту виникають численні точкові гідрофобні взаємодії і водневі зв'язки.
Вплив різних факторів середовища на ферментативні процеси (температури, концентрації водневих іонів і ін.).
Будучи білками, ферменти мають усі їхні властивості. Водночас біокаталізатори характеризуються рядом специфічних якостей, що теж витікають із їхньої білкової природи. Ці якості відрізняють ферменти від каталізаторів звичайного типу. Сюди відносяться термолабільність ферментів, залежність їхньої дії від значення рН середовища, специфічність і, нарешті, вплив активаторів і інгібіторів.
Термолабільність ферментів пояснюється тим, що температура, з одного боку, впливає на білкову частину ферменту, приводячи при занадто високих значеннях до денатурації білку і зниження каталітичної функції, а з іншого боку, впливає на швидкість реакції утворення фермент-субстратного комплексу і на всі наступні етапи перетворення субстрату, що веде до посилення каталізу.
Залежність каталітичної активності ферменту від температури виражається типової кривої. До деякого значення температури (у середньому до 5О°С) каталітична активність росте, причому на кожні 10°С приблизно в 2 рази підвищується швидкість перетворення субстрату. У той же час поступово зростає кількість інактивованого ферменту за рахунок денатурації його білкової частини. При температурі вище 50°С денатурація ферментного білку різко посилюється і, хоча швидкість реакцій перетворення субстрату продовжує рости, активність ферменту, що виражається кількістю перетвореного субстрату, падає.
Детальні дослідження зростання активності ферментів із підвищенням температури, проведені останнім часом, показали більш складний характер цієї залежності, чим зазначено вище: у багатьох випадках вона не відповідає правилу подвоєння активності на кожні 10°С в основному через поступово наростаючіх конформаційні зміни в молекулі ферменту.
Температура, при котрій каталітична активність ферменту максимальна, називається його температурним оптимумом.
Температурний оптимум для різноманітних ферментів неоднаковий. У загальному для ферментів тваринного походження він лежить між 40 і 50°С, а рослинного - між 50 і 60°С. Проте є ферменти з більш високим температурним оптимумом, наприклад, у папаїну (фермент рослинного походження, що прискорює гідроліз білку) оптимум знаходиться при 8О°С. У той же час у каталази (фермент, що прискорює розпад Н2О2 до Н2О й О2) оптимальна температура дії знаходиться між 0 і -10°С, а при більш високих температурах відбувається енергійне окислювання ферменту і його інактивація.
Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату
Число молекул субстрату, що змінюються протягом хвилини, у розрахунку на одиницю ваги ферменту при оптимальних умовах його дії називається молекулярною активністю ферменту. При збільшенні кількості ферментів швидкість ферментативної реакції підвищується до деякої межі, що характеризується кількістю субстрату, доступним дії ферменту.
У той же час, при постійній концентрації ферменту збільшення кількості субстрату призводить спочатку до швидкого, потім до більш повільного росту швидкості ферментативної реакції, поки не досягається максимальна швидкість, що залишається практично незмінною при подальшому збільшенні концентрації субстрату.
Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату може бути описана рівнянням:
де V -швидкість ферментативної реакції, Vmax - максимальна швидкість при нескінченно великій концентрації субстрату, S - концентрація субстрату в моль/л, Кm - константа Міхаеліса (вона відповідає концентрації субстрату, при якій швидкість реакції дорівнює половині максимальною і служить мірою хімічної спорідненості меду ферментом і субстратом, мірою їхньої спроможності утворювати фермент-субстратниый комплекс).
6.3.Залежність активності ферменту від значення рН середовища
Дана залежність була встановлена понад 50 років тому. Для кожного ферменту існує оптимальне значення рН середовища, при якому він виявляє максимальну активність. Більшість ферментів має максимальну активність у зоні рН поблизу від нейтральної точки. У різко кислій або різко лужному середовищі добре працюють лише деякі ферменти.
Перехід до більшої або меншої (у порівнянні з оптимальної) концентрації водневих іонів супроводжується більш-менш рівномірним падінням активності ферменту.
Вплив концентрації водневих іонів на каталітичну активність ферментів полягає у впливі її на активний центр. При різних значеннях рН у реакційному середовищі активний центр може бути слабше або сильніше іонізований, більше або менше екранований сусідніми з ним фрагментами поліпептидного ланцюга білкової частини ферменту і т.п. Крім того, рН середовища впливає на ступінь іонізації субстрату, фермент-субстратного комплексу і продуктів реакції, дуже впливає на стан ферменту, визначаючи співвідношення в ньому катіонних і аніонних центрів, що позначається на третинній структурі білкової молекули. Остання обставина заслуговує особливої уваги, тому що певна третинна структура білка-ферменту необхідна для утворення фермент-субстратного комплексу.
Активатори та інгібітори
На прояв каталітичної активності ферментів впливають активатори й інгібітори, що утворюються в тканинах або надходять в організм із зовнішнього середовища.
Активатори збільшують, а інгібітори пригнічують активність ферментів. Багато ферментів виробляються в організмі в неактивній формі у виді проферментів. Перехід їх в активну форму відбувається під впливом різноманітних активаторів. У якості активаторів можуть діяти іони, специфічні ферменти, гормони. Так, фермент амілаза, що розщеплює крохмаль, активується іонами хлору; пепсин утвориться з неактивного пепсиногена під впливом високої концентрації водневих іонів; активність гексокінази, що каталізує перетворення глюкози в її фосфорний ефір, збільшується під впливом гормону інсуліну.
Утворення ферментів спочатку в неактивній формі - це пристосування живого організму, що охороняє тканини від саморуйнування. Не менше важливо для організму дія інгібіторів, що можуть незворотньо виводити фермент із ладу (інактивувати) або тимчасово знижувати його активність.
Якщо інгібітор по просторовій структурі нагадує субстрат, то він може спричиняти так зване конкурентне інгібування активності ферменту, займаючи місце субстрату в його активному центрі і нестійко зв’язуватись із ним. Конкурентним інгібітором може бути, наприклад, стрептоцид, що займає місце ростового чинника бактерій - параамінобензойної кислоти - в активному центрі одного з бактеріальних ферментів
Інший вид інгібування - неконкурентне гальмування. Неконкурентні інгібітори вступають у необоротну хімічну взаємодію з окремими функціональними групами активного центру і блокують його.
Локалізація ферментів у клітині
Всі ферменти, у залежності від місця синтезу і місця їхні дії діляться на дві великі групи:
Внутрішньоклітинні ферменти діють у тих же клітинах, де і синтезуються.
Позаклітинні виходять із клітин у шлунково-кишковий тракт, у кров, лімфу, в інші біологічні рідини і там виконують свої біологічні функції.
Розрізняють конститутивні ферменти, що постійно присутні у клітинах, і індуцибельні ферменти, біосинтез яких активується під впливом відповідних субстратів. Деякі функціонально взаємозалежні ферменти утворюють у клітині структурно організовані поліферментні комплекси. Багато ферментів і ферментних комплексів міцно пов'язані з мембранами клітини або її органоїдами (мітохондріями, лізосомами, мікросомами і т.д.) і беруть участь в активному транспорті речовин через мембрани.
Одним із принципових відмінностей ферментів від каталізаторів небіологічного походження є кооперативний характер їхньої дії. На рівні одиночної молекули ферменту кооперативний принцип реалізується в тонкій взаємодії субстратного, активного й алостеричного центрів. Проте набагато більше значення має кооперативне здійснення реакцій на рівні ансамблів ферментів. Саме завдяки наявності систем ферментів - у вигляді мультиензимних комплексів або ще більш складних утворень - метаболонів, що забезпечують каталітичні перетворення всіх учасників єдиного метаболічного циклу - у клітинах із великою швидкістю здійснюються багатостадійні процеси як розпаду, так і синтезу органічних молекул. Ферментативний каталіз у багатостадійних реакціях йде без виділення проміжних продуктів: тільки виникнувши, вони відразу піддаються подальшим перетворенням.
Це можливо лише тому, що в клітинному вмісті ферменти розподілені не хаотично, а строго упорядковано. З сучасної точки зору клітина представляється высокоорганізованою системою, в окремих частинах якої здійснюються строго визначені біохімічні процеси. Відповідно до приуроченості їх до визначеним субклітинним частинам або відсікам (компартментам) клітини в них локалізовані ті або інші індивідуальні ферменти, мультиензимніе комплекси, поліфункціональні ферменти або метаболони.
Різноманітні гідролази і ліази зосереджені переважно в лізосомах. Усередині цих порівняно невеликих (декілька нанометрів у діаметрі) пухирців, обмежених мембраною від гіалоплазми клітини, протікають процеси деструкції різноманітних органічних сполук до тих найпростіших структурних одиниць, із яких вони побудовані. Складні ансамблі окисно-відновних ферментів, такі, наприклад, як цитохромна система, знаходяться в мітохондріях. У цих же субклітинних частинах локалізований набір ферментів циклу дикарбонових і трикарбонових кислот. Ферменти активування амінокислот розподілені в гіалоплазмі, але вони ж є й у ядрі. У гіалоплазмі присутні численні метаболони гліколізуа, структурно об'єднані з такими пентозофосфатного циклу, що забезпечує взаємопереключення дихотомічного й апотоміческого шляхів розпаду вуглеводів. У той же час ферменти, що прискорюють переніс амінокислотних залишків на кінець поліпептидного ланцюга, що росте, і деякі інші реакції, що каталізуються, у процесі біосинтезу білка, зосереджені в рибосомальному апараті клітини. Нуклеотидилтрансферази, що прискорюють реакцію переносу нуклеотидних залишків при новотворі нуклеїнових кислот, локалізовані в основному в ядерному апараті клітини.
Таким чином, системи ферментів, зосереджені в тих або інших структурах, беруть участь у здійсненні окремих циклів реакцій. Будучи тонко координованими один з одним, ці окремі цикли реакцій забезпечують життєдіяльність клітин, органів, тканин і організму в цілому.
Контрольні питання
1. Що таке швидкість хімічної реакції? Під дією яких чинників вона може змінюватися?
2. Який стан у системі речовин, що реагують, називається хімічною рівновагою? Що таке зсув рівноваги?
3. Як дослідним шляхом довести білкову природу ферменту?
4. Яка ділянка молекули ферменту називається активним центром? Коферментом? Апоферментом? Яка роль цих структур у ферментативному каталізі?
5. Що таке ізоферменти? Яку роль у біохімічному контролі за життєдіяльністю організму може зіграти їхнє визначення в крові?
6. У чому сутність активації й інгібування ферментів? Що таке алостерична регуляція активності ферментів?
7. Приведіть приклади регуляції Ферментативної активності зміною реакції середовища, іонами металів, гормонами, ферментами-кіназами.
8. У чому полягає хімізм ферментативного каталізу?
9. Чим пояснюється специфічність дії ферментів? Приведіть приклади абсолютної і відносної специфічності ферментів.
10. На чому засновується класифікація ферментів? Приведіть приклади ферментів різноманітних класів.
