Определение активности аскорбатоксидазы

Аскорбатоксидаза (1.10.3.3) в качестве функциональной группы содержит медь. Фермент, который катализирует окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую, согласно реакции:

О= С ¾¾					О= С ¾¾
½					½
НО¾С			аскорбат-	О = С
|| О	+ 1/2 О2		¾¾¾¾¾>	|| О	+	Н2О
НО¾С			оксидаза	О = С
½					½
Н¾С¾¾					Н¾С ¾¾
½					½
НО¾С¾Н					НО¾С¾Н
½					½
СН2ОН					СН2ОН
L - аскорбиновая дегидро - L - аскорбиновая кислота кислота

Медь в ходе ферментативной реакции меняет свою валентность.

Аскорбатоксидаза содержится во многих высших растениях. Она ответственна за разрушение витамина С при технологической переработке этих растительных материалов. Нежелательное действие фермента можно предотвратить, подвергнув его кратковременному нагреванию (денатурации) - бланшировке. В тоже время аскорбатоксидаза положительно влияет на окраску и аромат растительных продуктов, например, соков, связывая кислород.

Принцип метода заключается на свойстве аскорбиновой кислоты поглощать максимум света при длине волны 265 нм. Об активности фермента судят по уменьшению величины оптической плотности, учитывая, что степень окисления аскорбиновой кислоты пропорциональна количеству фермента.

Ход работы. Навеску листьев 1 г ± 0,001 г тщательно растирают в фарфоровой ступке и переносят в мерную колбу на 50 мл с помощью охлажденного фосфатного буфера. Экстракт центрифугируют при 4000 об/мин или фильтруют на холоде в течении короткого времени. В опытную кювету вносят 0,1 мл раствора МgSO₄; 2 мл фосфатного буфера; 0,1 мл ферментной вытяжки (центрифугата или фильтрата) и 0,7 мл аскорбиновой кислоты. Устанавливают нулевое положение на приборе по кювете, в которой вносят те же компоненты, что и в опыте, только вместо аскорбиновой кислоты приливают 0,7 мл воды. С началом измерения опытного образца включают секундомер. Первое измерение проводят через 30 с, а затем повторно каждую минуту в течении 5 - 6 минут или другой интервал времени, в зависимости от активности фермента.

При длительной экспозиции делают контроль на самоокисление аскорбиновой кислоты. Для этого в кювету спектрофотометра вносят 2,3 мл фосфатного буфера и 0,7 мл аскорбиновой кислоты, определяют оптическую плотность контрольного раствора в те же промежутки времени, что и основного раствора.

Активность фермента Е, выраженную в единицах оптической плотности, вычисляют по формуле:

(D₁ - D ₂) × а × с

Е = ¾¾¾¾¾¾¾¾, (4)

(t₁ - t₂) × b × n

где Е - активность фермента;

D₁ - оптическая плотность раствора в начале определения;

D₂ - оптическая плотность раствора через определенный промежуток времени;

а - общий объем экстракта, мл;

b - объем фильтрата в кювете, мл;

с - общий объем жидкости в кювете, мл;

t - время, мин;

n - масса навески, г.

Материалы и реактивы: фосфатный буфер с рН 7,3- 7,4 (см. Приложение В, п. 11); 0,005 М раствор КСI; 0,005 М раствор МgSO₄; 0,00005 М раствор аскорбиновой кислоты.

Оборудовани: фарфоровые ступки; пестик; пипетки; мерные колбы на 50 мл; центгифуга; спектрофотометр; кюветы; секундомер.