Методы очистки и выделения белков

Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также изучения их химического состава и структуры непременным условием является их выделение в химически чистом, гомогенном состоянии. Последовательность операций при этом следующая:

1. измельчение биологического материала (гомогенизация),

2. извлечение протеинов (перевод их в растворенное состояние- экстракция),

3. выделение исследуемого белка из смеси других (очистка и получение индивидуального белка).

Все методы разделения смесей основаны на том, что их компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга. Очищение индивидуальных белков является ступенчатым процессом, т.к. на первых этапах очистки фракции содержат множество примесей.

Остановимся на наиболее распространённых методах.

1. Ультрацентрифугирование. В его основе лежат различия в молекулярных массах протеинов. В кювету помещают раствор буфера и сверху наносят тонкий слой смеси белков. Сосуд помещают в ультрацентрифугу, при вращении ротора которой создаётся центробежное ускорение, пропорциональное молекулярной массе протеинов. В результате последние оседают в растворе буфера. Причём выпавший осадок расслаивается на отдельные фракции, имеющие разную молекулярную массу (Мr). Их можно легко извлечь. Но этот способ требует много времени и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны более простые методы (гель-хроматография и электрофорез).

2. Гель-фильтрация (гель-фильтрационная хроматография). Метод основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярными массами, по-разному распределяются между подвижной и неподвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется пористым гелем полисахарида (сефадекса, сефактила, агарозы и др.), представленным в виде гранул с порами. Их размер можно выбирать в зависимости от целей исследования. Внутри гранул находится жидкость, в которую могут проникать низкомолекулярные соединения и белки с небольшой Мr (молекулярной массой). На хроматографическую колонку наносят изучаемую смесь и с помощью подвижной фазы растворителя, вымывают большие мицеллы (белков), а малые, проникая внутрь гранул, задерживаются на некоторое время. Используя диаметр пор оценивают размеры молекул. Легко рассчитать молекулярную массу исследуемого белка, зная объем растворителя.

3. Электрофорез использует способность протеинов двигаться в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду и обратно пропорциональной их массам. Белки с отрицательным зарядом перемещаются к аноду (+), а с положительным – к катоду (-). Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном гелях или полиакриламидном (ПААГ) и т.д. (рис.). Для обнаружения локализации полимеров носители обрабатывают красителем (бромфеноловым синим или амидовым чёрным), что позволяет обнаружить пятна окрашенных белков.

4. Диализ применяют для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих больших размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как вода и низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе. Чаще всего с этой целью используют пленки из целлофана (нитрат целлюлозы). В лаборатории подлежащую диализу смесь помещают в мешок из целлофана и погружают последний в буферный раствор. Непрерывный ток воды через сосуд приводит к полному выходу содержащихся в целлофане низкомолекулярных веществ, а белки остаются внутри.

 

КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

Часть белков включает только аминокислоты, но чаще из-за их лигандности в организме формируются более сложные структуры. Поэтому их и классифицируют следующим образом:

Рис. Классификация белков

Простые белки

Простые белки – это биополимеры, состоящие только из аминокислот.

По форме они подразделяются на глобулярные и фибриллярные.

Глобулярные белки

Они довольно сложно организованы, имеют третичную структуру, поэтому растворимы в воде. Из-за направленности заряда их делят на:

1) Основные. В этих белках содержится много основных аминокислот (аргинина и лизина), поэтому в растворе их молекулы приобретают положительный заряд, что облегчает их растворимость.

Наиболее яркие представители:

Протамины - самые маленькие низкомолекулярные белки (Мr» 5000 Д), впервые выявлены в зрелой сперме некоторых рыб. Включают до 85% аргинина. Являются основными компонентами нуклеопротеидов хроматина ядра спермиев, а также полирибосом, что сохраняет и регулирует передачу генетической информации при делении клеток и между особями.

Гистоны – белки с большей, чем у протаминов, молекулярной массой от 11 до 21 тыс. Д. Вклад основных аминокислот лизина и аргинина меньше и составляет от 20 до 30%. Это гетерогенная фракция. Различают 5 классов гистонов: Н₁, Н_2а, Н_2b, Н₃, Н₄. Их молекулы (кроме Н₁) легко взаимодействуют друг с другом, образуя мультимеры – октамеры. В свободном виде они не встречаются, а входят в состав сложных белков – нуклеопротеидов (рис.), выполняя следующие функции: структурную и регуляторную. Первая заключается в формировании и стабилизации пространственной структуры молекулы ДНК. А регуляторная – находясь в связи с этим хранителем информации, они блокируют её передачу на РНК.

2) Кислые. Это широко распространённые белки внеклеточных жидкостей. Наиболее богаты ими плазма крови, лимфа, ликвор, молоко и т.д. Из-за преобладания в них кислых аминокислот (глутамата и аспартата) растворы имеют ярко выраженный кислый характер.

К ним относят:

Альбумины. Их Мr = 40-70 тыс.Д. Молекулы представляют одну полипептидную цепь небольших размеров. Из-за высокого содержания глутаминовой кислоты имеют солидный отрицательный заряд. Это сильно гидратированные белки (с огромной гидратной оболочкой), поэтому осаждаются только при большой концентрации водоотнимающих средств, а также устойчивы к нагреванию.

Характерным свойством альбуминов является их способность связывать лиганды и адсорбировать на своей поверхности вещества, перенося их с током крови. Таким способом в комплексе с альбуминами плазмой крови доставляются к клеткам гормоны, липиды, витамины, лекарства, яды, катионы металлов и т.д.; кроме того эти протеины обеспечивают онкотическое давление плазмы крови и являются её составляющей буферной системы.

Глобулины – это белки с большой молекулярной массой свыше 150 тыс. Д. По сравнению с альбуминами, в их составе меньше кислых аминокислот. В отличие от них это слабо гидратированные мицеллы, поэтому легко высаливаются. Кроме того они гетерогенны, что подтверждается при электрофорезе на бумаге, после разгонки регистрируют пять фракций: a₁, a₂, β₁, β₂, g. Последняя является самой крупной и наиболее гетерогенной. В ней сосредоточены некоторые факторы свёртывания крови и разнообразные антитела (иммуноглобулины). Отсюда следует, что глобулины выполняют не только функции, подобные альбуминам, но и предохраняют организм от неадекватных кровопотерь и участвуют в его иммунной защите. Они являются составляющей сложных белков – гликопротеинов и липопротеинов.

Соотношение альбуминов и глобулинов в плазме крови называется белковым коэффициентом (a).

В норме он сохраняется на постоянном уровне и составляет 1,5 – 2,3.

Его изучают с целью диагностики различных патологических состояний. Например: при инфекционных заболеваниях после разделения белков плазмы крови оценивают соотношение величин альбуминов и глобулинов и находит белковый коэффициент (a). Если организм борется с инфекцией, то закономерно повышается уровень иммунных защитников g-глобулинов в крови, что снижает значения дроби: белковый коэффициент a<1,5. Если не борется (что плохо), то величины a остаются в пределах нормы, следовательно, врачебная тактика должна быть более активной: требуется дополнительное введение иммуностимуляторов (веществ, усиливающих образование антител), или готовых g-глобулинов.

Фибриллярные белки

Уровень организации этих белков включает лишь вторичную структуру, поэтому они не очень хорошо растворимы в воде. Среди них выделяют:

1) Растворимые в воде и её солевых растворах

Миозин - основной сократительный белок. Мr = 470 тыс. Д. Его молекула имеет сильно вытянутую форму и состоит из субъединиц, в состав которых входит по две полипептидные цепи (Н - тяжёлые и L- лёгкие). Две первые (Н с Мr = 210 000) закручены относительно друг друга в a-спираль, образуя гидрофобный хвост. Конец каждой такой тяжёлой нити совместно с несколькими лёгкими (L) цепями создают глобулу – гидрофильную головку, способную соединяться с актином. Необычное строение создаёт возможность совмещать в молекуле совершенно разные функции: структурную и каталитическую. Фибриллярная часть обеспечивает образование нитей мышечного волокна, а глобулярная головка служит ферментом, катализирующим гидролиз АТФ до АДФ и Р_н. Энергия, выделяющаяся в результате этой реакции, используется для осуществления мышечного сокращения.

Актин – глобулярный протеин с Мr = 42 000 Д. Это также сократительный белок представлен мелкими гранулами (G - форма), образующими цепь, которая в результате полимеризации приобретает структуру двухцепочечной спирали (F – актин) и напоминает нити бус, закрученные относительно друг друга.

Фибриноген – это гликопротеин с молекулярной массой 340 тыс. Д. Он синтезируется в печени и содержится в плазме крови. Молекула фибриногена состоит из 6 полипептидных цепей (2α, 2β, 2γ), связанных дисульфидными мостиками. В составе протеинов большое количество остатков аспартата и глутамата, что создаёт сильный отрицательный заряд, препятствующий их агрегации. Фибриноген является I плазменным фактором свёртывания крови. Участвует в образовании фибринового сгустка, превращаясь в фибрин (фактор Iа) путём частичного протеолиза.