Пример титрования люминесцирующего иммуноглобулина в присутствии альбумина

Препараты	Характерфлюоресценции	Интенсивность свечения при различных разведениях спе­цифического конъюгата в смеси с альбумином, взятом в рабочем разведении 1: 16	Красящийтитрлюминесцирующегоиммуноглобулина	Рабочееразведениеиммуноглобулинавсмесисальбумином
1:4	1:8	1:16	1:32	1:64
Мазокизсмыва	Специфическая зеленая	++++	++++	++++	+++	+	1:32	1:16
Неспецифическая красная	+	++	++	++	++
Мазокотпечатокселезенки	Специфическая зеленая	++++	++++	++++	+++	++	1:32	1:16
Неспеци­фическая красная	+	++	++	++	++
Монослойпереживаемыхклетокамнионачеловека	Специфическая зеленая	++++	++++	++	+++	+	1:32	1:16
Неспецифическая красная	-	+	++	++	++

 

* Красящий титр люминесцирующего иммуноглобулина в этом при­мере равен 1:32. Однако для окраски мазков специфический конъюгат, как и контрастирующий альбумин, используется в рабочем разведении, которое должно быть в два раза концентрированнее его красящего тит­ра. Следовательно, рабочая смесь конъюгатов, выбранная на основании приведенных в данном примере результатов, должна состоять из разве­денного 1:16 специфического люминесцирующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина, взятого в разведении 1:17. Чтобы полу­чить в рабочей смеси эти оптимальные соотношения, оба конъюгата должны быть разведены 1:8, а затем смешаны в равных объемах.

Правильно подобранная рабочая смесь должна обеспечи­вать оранжево-красную флюоресценцию фона препарата (ге­терологичных микроорганизмов, клеточных элементов и про­чих посторонних примесей) и яркое зеленое специфическое свечение антигена, гомологичного испытуемому люминесци­рующему иммуноглобулину.

Для окраски мазков используют полигрупповые, группо- ­и видоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины.

При исследовании мазков, приготовленных из нативного материала пробы (I и II ступени анализа), рекомендуется следующий порядок окраски.

1. При наличии полигрупповых препаратов вначале окра­шивают мазки на 1-м стекле, нанося:

- на 1-й квадрат стекла - полигрупповой бактериаль­ный люминесцирующий иммуноглобулин;

- на 2-й квадрат стекла - полигрупповой риккетсиозный люминесцирующий иммуноглобулин;

- на 3-й и 4-й квадраты - полигрупповые вирусные лю­минесцирующие иммуноглобулины (два препарата);

- на 5-й квадрат стекла - кокцидиоидозный люминесци­рующий иммуноглобулин.

Если с каким-либо полигрупповым диагностическим пре­паратом будет получен положительный результат, дополни­тельной окраске подлежат 2-е или 3-е стекло. При этом маз­ки 2-го стекла окрашивают видоспецифическими бактериаль­ными люминесцирующими иммуноглобулинами, а мазки 3-го стекла - видо- и группоспецифическими риккетсиозными или вирусными люминесцирующими иммуноглобулинами.

2. Если полигрупповые диагностические препараты отсут­ствуют то для окраски мазков сразу используют видо- и группоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины:

- для 2-го стекла - к возбудителям чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы (универсальные или антиспоро­вые), сапа и мелиоидоза;

- для 3-го стекла - к возбудителям эпидемического сып­ного тифа, Ку-лихорадки, группы клещевых пятнистых лихо­радок, пситтакоза, оспы и кокцидиоидоза.

Резервным стеклом с мазками иммунолюминесцентного анализа остается первое.

Для окраски мазков, приготовленных из взвесей после концентрирования пробы физическими способами (III стадия анализа), в основном используют те же диагностические пре­параты, что и при исследовании мазков из нативного мате­риала. Отличие состоит лишь в том, что из анализа исклю­чаются вирусные люминесцирующие иммуноглобулины. Кро­ме того, при целенаправленном исследовании проб воды к числу бактериальных диагностических препаратов в ряде случаев может быть добавлен холерный люминесцирующий иммуноглобулин.

При окраске пластин с монослоем клеток, зараженных в целях накопления вирусов (IV стадия анализа), рекомен­дуется следующий порядок.

1. При наличии полигрупповых диагностических препара­тов вначале окрашивают пластины 1-го стекла тремя раз­личными полигрупповыми вирусными люминесцирующими иммуноглобулинами. При получении положительного резуль­тата с каким-либо полигрупповым препаратом для иденти­фикации обнаруженного вируса дополнительно окрашивают пластины с монослоем клеток на 2-м и 3-м стеклах соответ­ствующими этому полигрупповому препарату видо - и группо­специфическими люминесцирующими иммуноглобулинами.

2. Если полигрупповые диагностические препараты отсут­ствуют, то для окраски пластин с монослоем клеток сразу используют видо- и группоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины:

- для пластин 1-го стекла - к альфавирусам, флавиру­сам и вирусу натуральной оспы;

- для пластины 2-го стекла - к аренавирусам и вирусам Марбург и Эбола;

- для пластин 3-го стекла - к вирусам конго-крымской геморрагической лихорадки и лихорадки долины Рифт.

Одна пластина 3-го стекла остается резервной на случай необходимости применения какого-либо дополнительного ди­агностического препарата. Стекла с пластинами, извлечен­ными на втором сроке, окрашивают в том же порядке.

Для окраски пластин с монослоем клеток, зараженных в целях накопления риккетсий и хламидий (IV стадия анали­за), сразу используют видо- и группоспецифические люми­несцирующие иммуноглобулины:

- для 1-й пластины - к риккетсиям эпидемического сып­ного тифа;

- для 2-й пластины - к возбудителю Ку-лихорадки;

- для 3-й пластины - к возбудителю пситтакоза.

Стекла с пластинами, извлеченными на втором сроке, окрашивают в том же порядке.

При окраске мазков-отпечатков брюшины и селезенки бе­лых мышей, использованных для биологического обогащения пробы (V стадия анализа), рекомендуется следующий поря­док.

1. При наличии полигрупповых люминесцирующих имму­ноглобулинов вначале окрашивают мазки на 1-м стекле, на­нося:

- на 1-й и 5-й квадраты (т. е. соответственно на отпе­чатки брюшины и селезенки) полигрупповой бактериальный диагностический препарат;

- на 2-й и 6-й квадраты - полигрупповой риккетсиозный диагностический препарат.

В случае обнаружения в окрашенных мазках бактерий для идентификации последних дополнительно окрашивают соответствующими бактериальными видоспецифическими люминесцирующими иммуноглобулинами мазки-отпечатки на 2-м и 3-м стеклах, а в случае обнаружения риккетсий - со­ответствующими риккетсиозными видо- и группоспецифически­ми диагностическими препаратами мазки-отпечатки на 4-м стекле.

2. При отсутствии полигрупповых диагностических препа­ратов для окраски мазков-отпечатков сразу используют ви­до- и группоспецифические бактериальные и риккетсиозные люминесцирующие иммуноглобулины.

Пятое стекло с отпечатками только селезенки, мышей пе­редают во 2-ю подгруппу идентификации БС, где его окра­шивают полигрупповыми люминесцирующими иммуноглобу­линами.

Для окраски мазков-отпечатков мозга мышей-сосунков, зараженных в целях накопления вирусов (V стадия анали­за), рекомендуется следующий порядок.

1. При наличии полигрупповых вирусных диагностических препаратов вначале окрашивают мазки на 1-м стекле тремя различными полигрупповыми люминесцирующими иммуно­глобулинами. В случае получения положительного результа­та с каким-либо из этих препаратов для идентификации вы­явленного вируса дополнительно окрашивают мазки-отпечат­ки на 2-м стекле соответствующими видо- и группоспецифи­ческими люминесцирующими иммуноглобулинами.

2. При отсутствии полигрупповых диагностических препа­ратов окраску сразу проводят видо- и группоспецифическими люминесцирующими иммуноглобулинами к альфавирусам, флавирусам, вирусу натуральной оспы, к вирусам Мачупо и Лаоса, вирусу Марбург, вирусу Эбола, к вирусам конго-крымской геморрагической лихорадки и лихорадки долины Рифт.