Лекции.Орг


Поиск:




Категории:

Астрономия
Биология
География
Другие языки
Интернет
Информатика
История
Культура
Литература
Логика
Математика
Медицина
Механика
Охрана труда
Педагогика
Политика
Право
Психология
Религия
Риторика
Социология
Спорт
Строительство
Технология
Транспорт
Физика
Философия
Финансы
Химия
Экология
Экономика
Электроника

 

 

 

 


Методы специфической индикации




Анализ материалов пробы с помощью метода флюоресцирующих антител (МФА)

Метод флюоресцирующих антител, выгодно сочетающий принципы иммунологического и морфологического исследо­ваний с люминесцентным анализом, отличается высокой чув­ствительностью и специфичностью. В основе его лежит реак­ция между искомым антигеном и люминесцирующим имму­ноглобулином, меченым специальными красителями - флюо­рохромами. Образующийся в результате такой реакции ком­плекс антиген + флюоресцирующее антитело приобретает способность светиться в синих и ультрафиолетовых лучах спектра.

Основным преимуществом МФА является возможность быстрого выявления, изучения локализации и идентифика­ции возбудителей бактериальных, риккетсиозных, вирусных, грибковых инфекций и их антигенов в препаратах, окрашен­ных гомологичными флюоресцирующими иммуноглобулина­ми. МФА в течение 1-2 ч позволяет обнаруживать не толь­ко жизнеспособные особи возбудителей, но и мертвые клет­ки, содержащиеся в препарате.

Для специфической индикации применяют прямой метод флюоресцирующих антител в сочетании с контрастированием неспецифического свечения. С этой целью для окраски маз­ков используют смесь, состоящую из равных объемов специ­фических флюоресцирующих антител, меченных флюоресце­ин-изотиоцианатом (излучающим зеленый цвет), и контра­стирующего альбумина нормальной сыворотки (лошадиной, бычьей, кроличьей), конъюгированного с родаминовыми кра­сителями (обладающими красной люминесценцией).

Для проведения специфической индикации с помощью прямого МФА необходимы:

- наборы сухих меченных флюоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) иммуноглобулинов;

- сухой сывороточный альбумин, меченный производны­ми родамина;

- химически чистый ацетон или этиловый спирт для фик­сации мазков;

- 0,01 М фосфатный буферный раствор (рН 7,2-7,4) с 0,87% хлорида натрия для отбывания препаратов в процессе их обработки люминесцирующими иммуноглобулинами;

- дистиллированная вода (нейтральной рН) для раство­рения сухих люминесцирующих конъюгатов и отмывания окрашенных мазков;

- 0,15 М (изотонический) - раствор хлорида натрия для приготовления рабочих разведении люминесцирующих конъ­югатов;

- нелюминесцирующее иммерсионное масло (или диме­тилфталат) и трис-глицериновая смесь для люминесцентной микроскопии;

- предметные и покровные стекла для приготовления мазков и препаратов для микроскопии;

- батарейные стаканчики для фиксации и отмывки окра­шенных препаратов;

- кюветы с крышками (влажные камеры) или чашки Петри для окраски мазков люминесцирующими иммуногло­булинами;

- пробирки, пипетки и прочая посуда для подготовки рабочих разведении люминесцирующих конъюгатов и обра­ботки ими мазков;

- люминесцентный микроскоп с источником питания. До начала работы люминесцирующие иммуноглобулины и контрастирующий альбумин растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке ампулы (обычно в 0,5 мл). К использованию пригодны лишь те конъюгаты, ко­торые легко и без осадка растворяются в течение 1-2 мин. Растворенные конъюгаты можно хранить при 2-40С в те­чение нескольких недель плотно закрытыми.

Окраску мазков производят так называемой рабочей смесью конъюгатов, которую также готовят заблаговремен­но, но срок ее хранения при 2-40С не должен превышать семи дней.

Важнейшим условием правильного составления рабочей смеси конъюгатов является оптимальный подбор в ней со­отношения люминесцирующего иммуноглобулина, меченного ФИТЦ, и альбумина, меченного производными родамина. Это достигается титрованием люминесцирующих конъюгатов на контрольных мазках, содержащих гомологичные люми­несцирующим иммуноглобулином микроорганизмы или их антигены (диагностикумы и т. п.).

Прежде всего, определяют красящий титр контрастирую­щего альбумина (табл. 1). Для этого из исходного раствора люминесцирующего альбумина готовят ряд двукратных разведений на забуференном изотоническом растворе. Затем полученные разведения наносят на мазки и инкубируют стекла с мазками во влажной камере при температуре 370С в течение 30 мин. Далее мазки дважды (каждый раз по 5 мин) отмывают забуференным изотоническим раствором и ополаскивают дистиллированной водой. После высушивания на воздухе мазки подвергают люминесцентной микроскопии.

Таблица 1





Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2015-10-01; Мы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 579 | Нарушение авторских прав


Поиск на сайте:

Лучшие изречения:

Чтобы получился студенческий борщ, его нужно варить также как и домашний, только без мяса и развести водой 1:10 © Неизвестно
==> читать все изречения...

2482 - | 2370 -


© 2015-2025 lektsii.org - Контакты - Последнее добавление

Ген: 0.009 с.