Гомогенизация проб и пробоподготовка

ГЛАВА 5. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ     МИКРООРГАНИЗМОВ

ГОМОГЕНИЗАЦИЯ ПРОБ И ПРОБОПОДГОТОВКА

______________________________

 

В главе представлены традиционные и совре­менные методы, отличающиеся повышенной точностью, чувствительностью и селективностью. Представить полный перечень методов культивирования микроорганизмов весьма затруднительно, так как их совершенствование идет непре­рывно и очень высокими темпами. Можно с уверенностью сказать, что возможности той или иной области науки продиктованы в первую очередь используемыми в ней ме­тодами, и материал, представленный здесь, крайне важен для пищевой ми­кробиологии. 

Основой пищевой микробиологии являются методы оценки пищевых продуктов на наличие, видовую принадлежность и чис­ленность микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности. Тем не менее ни один из используемых методов не позволяет определить точное число микроорганизмов в про­довольственном продукте, так как каждый метод имеет некоторые ограничения в использовании.

Для оценки общей численности микроорганизмов пользуются четырьмя методами исследования:

 СПК, АПК и КОЕ – это стандартный подсчет колоний (СПК), аэробный подсчет колоний (АПК), определение количества живых клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ);

НВЧ – метод подсчета наиболее вероятного числа, используемый для статис­тического определения количества жизнеспособных клеток;

 оценка числа жизне­способных клеток, обладающих восстанавливающей способностью;

 ОМС – прямой микроскопический подсчет, используемый для определения количества как жизнеспособных, так и нежизнеспособных клеток.

Любая проба, доставленная в лабораторию, нуждается в дополнительной гомогенизации перед ее сокращением — в противном случае ее представительность не может быть гарантирована. Если неоднородность пробы (наличие в ней различных фаз) видна на глаз, то качество гомогенизации может определять качество результатов анализа в целом. Стандартные рабочие методики, описывающие стадию подготовки пробы, должны предусматривать разнообразные способы гомогенизации. При оценке общей погрешности результатов необходимо количественно оценить погрешность, связанную со стадией сокращения пробы. Последняя погрешность определяет число сокращенных проб, которые следует проанализировать, чтобы достичь требуемой точности результатов анализа.

Пробоподготовка (подготовка пробы) — совокупность действий над объектом анализа (измельчение, гомогенизация, экстракция, гидролиз, осаждение и пр.) с целью превращения пробы в подходящую для последующего анализа форму (сухой остаток, раствор и пр.), состояние вещества (основание, солевая форма, гидролиз конъюгатов и пр.), а также для концентрирования/разбавления аналита и избавления от мешающих анализу компонентов.

Пробоподготовку обеспечивает система пробоподготовки - совокупность технических устройств (мешалки, дробилки, смесители, центрифуги, регуляторы давления, регуляторы расхода, дозаторы и т.д.), последовательно или параллельно производящих необходимые превращения, а также контрольно-измерительные приборы, измеряющие и контролирующие параметры технологических операций (уровнемеры, манометры, термометры и т.д.).

Основная задача пробоподготовки — подготовка вещества, материалов, компонентов анализа для определенного вида анализа. Пробоподготовка помогает повысить точность получаемых результатов, расширить исследуемый диапазон значений, повысить безопасность исследования, ускорить тест, улучшить воспроизводимость и погрешность результатов.

Пробоподготовка состоит из 16-ти следующих последовательных процедур:

Для выполнения перечисленных процедур пробоподготовки используется необходимое количество основного оборудования.

Гомогенизация - процесс уменьшения неоднородности смесей, состоящих из твердых веществ в текучей среде (жидкостях или газах) путем измельчения и равномерного перераспределения их по объему. Например, при помощи гомогенизации, жир в молоке может быть разбит так тщательно, что частицы повторно не рекомбинируются, и сливки не образуются.

Техника гомогенизации состоит из следующих способов:

перемешивание дисперсных систем с жидкой дисперсионной средой быстро вращающимся ротором диспергатора или венчиком;

прокачивание дисперсных систем типа жидкость/жидкость (например, молока) под давлением до 5-400 атмосфер через отверстие головки гомогенизатора, возникающие при этом гидродинамические силы дробят фрагменты дисперсной фазы на более мелкие;

перемешивание порошков в многоосных, в Y-образных или в Z-образных смесителях;

ультразвуковая кавитационная гомогенизация дисперсных систем газ/жидкость и жидкость/газ.

Вплоть до конца 1970-х гг. образцы перед посевом почти исключительно измельчали механически путем растирания, разрезания на мелкие кусочки и т.п.. A.N. Sharpe и A.K. Jackson в 1971 г. разработали устройство для гомогениза­ции пищевых продуктов. Гомогенизатор представляет собой относительно простое устройство, гомогенизирующее образцы в специальном пластиковом боксе энергичным ударом двух лопастей. Эффект удара состоит в разрезании образ­цов пищевых продуктов; выделяющиеся при этом микроорганизмы суспенди­руются в растворителе (рис.5.1.).

Рис.5.1. Гомогенизатор Stomacher лабораторный ECO Blender II (PBI)

 

Гомогенизатор Stomacher можно сопоставить с высокоскоростным блендером для анализа пищевых продуктов. Подсчет колоний для образцов, об­работанных на Stomacher, не отличается от такового для образцов, обработан­ных блендером. Это устройство предпочтительнее блендера по следующим причинам:

 не требуется чистить и складировать контейнеры блендера;

не повышается температура образца;

 гомогенаты могут сохраняться в контейнерах Stomacher в замороженном со­стоянии для дальнейшего исследования;

 уровень шума значительно ниже, чем у механического блендера.

Показано уменьшение ле­тального действия Stomacher по сравнению с блендером на Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis и Escherichia coli. Stomacher специфичен для пищевых продуктов; для некоторых типов пи­щевых продуктов он предпочтительнее, чем высокоскоростное перемешивание, но не для всех.

При гомогенизации мяса с использованием Stomacher не происходит обширное разру­шение тканей мяса, и как следствие, в составе гомогената в меньшем количестве присут­ствовали восстанавливающие компоненты, взаимодействующие с резазурином; тогда как при перемешивании уровень восстанавливающих компонентов, взаи­модействующих с резузурином, был значительно выше.

Устройство под названием «Pulsifier» до некоторой степени сходно со Stomacher. В нем создается высокий уровень турбулентности в пищевых продуктах, что приводит к более полному извлечению микроорганизмов из образца.

Гомогенизатор Pulsifier имеет электромотор, приводящий в движение ударное кольцо из нержавеющей стали, которое дополнит-ельно вибрирует для интенсивного перемешивания/взбалтывания пробы. Это обеспечивает максимальный переход микроорганизмов из образца в суспензию, не деформируя продукт. Он позволяет произвести подготовку пробы с максимальной экстракцией бактериальных клеток. 

Проба помещается в специальный пакет, который плотно запеча-тывается во избежание попадания в окружающее пространство аэрозоля, содержащего бактерии. За процессом гомогенизации можно наблюдать через прозрачное окно. Контрольная LCD панель позволяет устанавливать программу или время, а также имеет кнопку «Пауза», чтобы иметь возможность остановить процесс и затем продолжить его, не начиная заново.

Гомогенизатора Pulsifier имеет следующие преимущества:

суспензия более чистая и менее густая, чем при обработке другими приборами.

образец после обработки содержит меньше пищевых частиц.

образцы более пригодны для молекулярных методов исследования.

затрачивается меньше времени на подготовку образца.