Регистрация результатов реакции Райта

Методы микробиологической диагностики чумы

А. Бактериологический

Материал: от больных - пунктат из бубона, мокрота, кровь из вены; от трупов - кусочки органов, лимфоузлы, кровь, костный мозг.
Микроскопия			МПА и МПБ (с 0, 1% крови кролика или лошади, с 0,05% сульфита натрия и антифаговой сывороткой). Инкубирование при 25-30° C
Микроскопия	МПА
Пестрый ряд	Реакция агглютинации со специфической сывороткой	Отношение к специфическому фагу		Заражение морской свинки втиранием в кожу, подкожно, внутрибрюшинно

Б. Биологический

 

Исследуемый материал (см. метод А)

 

В. Аллергический

(для ретроспективной диагностики) – проба с пестином.

Г. Серологический

Применение иммунологических реакций для обнаружения антигенов возбудителя (РПГА и ее модификации, ИФМ, РИМ).

 

 

Методы микробиологической диагностики туляремии

А. Бактериологический и биологический

Материал: пунктат из бубона, гной из конъюнктивы, пленка из зева

Б. Серологический

Реакция агглютинации по типу реакции Райта (с 10-12 дня заболевания,

диагностический титр 1:100)

 

В. Аллергический

Аллергическая проба с тулярином – накожная и внутрикожная

 (с 5-7 дня заболевания).

 

Приложение к ЗАНЯТИЮ 1

А. Иерсинии - возбудители псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis)

 и кишечного иерсиниоза (Y. enterocolitica)

Эти два вида иерсиний играют значительную роль в патологии че­ловека. Бактерии представляют собой полиморфные, не образующие спор грамотрицательные палочки, имеющие часто овоидную форму. Клетки в старых культурах окрашиваются неравномерно. Бактерии псевдотуберкулеза, взятые с влажного агара, могут иметь биполярную окраску, об­разуют капсулу, но с различной степенью выраженности. Оба вида бак­терий обладают подвижностью, обусловленной наличием перитрихиальных жгутиков. Подвижность выявляется посевом в столбик полужидкого агара уколом, но только при 18-20ºC, при 37°C подвижность отсутствует.

Иерсинии неприхотливы к питательным средам, хорошо растут на обычных универсальных средах, способны активно размножаться в почве и воде. Оптимальная для роста температуре 30ºС, верхняя и нижняя границы роста составляют 43°С и 0-2°С соответственно, оптимум рН 6,6-7,8. На среде Эндо колонии имеют диаметр 0,1-0,2 мм, круглые вы­пуклые, блестящие с ровными краями, бесцветные (не ферментируют лак­тозы). Колонии возбудителя псевдотуберкулеза, находящиеся в R-форме, почти не отличаются от колонии возбудителя чумы (пигментированный центр и фестончатый "кружевной"край). Биохимические различия трех видов иерсиний представлены в таблице.

Все три вида иерсиний отличаются и по своим антигенным свой­ствам.

Возбудитель псевдотуберкулеза по O-антигенам разделяется на восемь групп (1-8) с 20 O-факторными антигенами (1-20). По O- и Н-антигенам (а-е) этот вид подразделяют на 13 сероваров и подсероваров (la, 1в, 2а, 2в, 2с, 3, 4а, 4в, 5а, 5в, 6, 7, 8).

Y. enterocolitica характеризуется антигенной неоднород­ностью по 0-антигену. В настоящее время различают более 30 сероваров этого вида. Большинство из них адаптированы к некоторым видам животных или широко распространены во внешней среде. Подавляющее большинство штаммов, выделенных от человека, принадлежат к сероварам 03 и 09, реже встречаются серовары 08, 05в и очень редко - серовары 01, 02, 06, 07, 010, 011, 013, 014, 015, 016, 017.

От людей, больных псевдотуберкулезом, чаще всего выделяются штаммы, относящиеся к серовару 1, реже 3 и 4.

В ходе эволюции у иерсиний закрепилась необходимость существо­вания в двух средах обитания - внешней (сапрофитическая фаза жизни) и в организме теплокровных животных и человека (паразитическая фаза). Для осуществления паразитической стадии иерсинии должны проникнуть в организм теплокровного животного. Заражение возбудителем псевдо­туберкулеза чаще всего происходит при употреблении в пищу инфициро­ванных иерсиниями продуктов, хранившихся при пониженной температу­ре (4-12ºС) в холодильниках и овощехранилищах. В этих условиях бак­терии в силу своей психрофильности могут размножаться и накаплива­ться в пищевых субстратах.

Иерсинии при пониженной температуре обладают высоким потенциа­лом клеточной и тканевой инвазивности и способны сохранять высокий уровень вирулентности, однако возбудитель может проникнуть в орга­низм человека и через любые слизистые оболочки, вероятно, за счет неспецифических механизмов.

Основным источником иерсиниозов являются дикие и синантропные грызуны, домашние и сельскохозяйственные животные. Возможно зара­жение человека от человека. Штаммы Y. pseudotuberculosis выделены от 175 видов млекопитающих, 124 видов птиц, 7 видов рыб. Зараженные грызуны, животные и люди выделяют возбудителя с испражнениями и мо­чой, загрязняя воду, растения и другие объекты внешней среды. Таким образом, пищевой путь в передаче возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза является ведущим. Заражение происходит в ре­зультате употребления в пищу сырых или недостаточно термически обра­ботанных продуктов (мяса, мясных продуктов, молока, овощей, фруктов, зелени). Оба вида возбудителя способны существовать внутри растений (салата, гороха, овса и т.п.).

Заболевания, вызываемые иерсиниями, характеризуются полиморфностью клинических проявлений, поражением желудочно-кишечного тракта, тенденцией к генерализации, септикопиемии и поражению различных ор­ганов и систем.

Патогенные свойства иерсиний обоих видов, как и возбудителя чу­мы, во многом определяются наличием у них плазмид с молекулярной массой 42-48 МД и 82 МД. Плазмиды контролируют такие свойства возбу­дителей, как зависимость роста от наличия в среде кальция, способ­ность синтезировать антигены вирулентности (v-w), пили адгезии, спо­собность вызывать кератоконъюнктивит у морской свинки и т.п.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает использо­вание бактериологического метода и серологических реакций.

При бактериологическом методе исследуемый материал от больных (испражнения, кровь, слизь из зева), а также подозрительные продук­ты или воду засевают на среды Эндо, Плоскирева, Серова (индикатор­ную и дифференциальную) и инкубируют при 37°C в течение 48-72 часов.

Подозрительные колонии (мелкие бесцветные на средах Эндо и Плоскирева и окрашенные колонии двух различных форм на средах Серова) пересевают для получения чистых культур, которые идентифицируют по биохимическим признакам и окончательно типируют с помощью диагности­ческих агглютинирующих сывороток.

Для серологической диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза используют развернутую реакцию агглютинации (по типу реакции Видаля) с соответствующими диагностикумами или реакцию пас­сивной гемагглютинации (РПГА) с антигенным эритроцитарным диагностикумом. Положительными считают реакции при титре антител 1:400 и вы­ше. Реакции рекомендуется ставить с парными сыворотками (с интерва­лом в несколько дней). Нарастание титра антител будет свидетельство­вать о специфичности инфекционного процесса.

 

Б. Дифференциальные признаки биоваров Y. р estis

Признак	Биовары Y. pestis
	Y. antiqua	Y. mediaevalis	Y. orientalis
Ферментация:
глицерина	+	+	-
мелибиозы	-	+	-
Восстановление нитратов в нитриты	+	-	+
Область распространения:
Центральная Азия	+	-	+
Центральная Африка	+	-	+
Иран, Средняя Азия	-	+	+
Другие эндемичные регионы	-	-	+

 

В. Отечественная классификация вида Yersiniapestis (Саратов, 1985)

 

Y. pestissubsp. pestis                      - основной подвид

Y. pestissubsp. altaica        - алтайский подвид

Y. pestissubsp. caucasica               - кавказский подвид

Y. pestissubsp. hissarica                 - гиссарский подвид

Y. pestissubsp. ulegeica                  - улэгейский подвид

 

Г.  Особенности генетического контроля факторов

патогенности у возбудителя чумы

 

Контроль наиболее важных факторов патогенности возбудителя чу­мы осуществляется плазмидами, на которых локализованы гены вирулентности. Известны три плазмиды, контролирующие важнейшие факто­ры патогенности возбудителя: рYР (м.м.6 МД); рYТ (м.м. 60 МД) и рYV (м.м. 47 МД).

Плазмида рYР (6 МД) несет гены, определяющие синтез пестицина. фибринолизина и плазмокоагулазы.

Плазмида рYТ (60 МД) несет детерминанты, контролирующие синтез антигена фракции I и "мышиного"токсина.

Плазмида рYV (47 МД) ответственна за синтез антигенов v и w и термоиндуцибельных белков внешней мембраны, а также зависимость роста чумной палочки от наличия в среде ионов Са⁺⁺.

 

Д. Основные различия между возбудителями чумы,

псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза

 

Признак	Вид возбудителя
	Возбудитель чумы	Возбудитель псевдотуберкулеза	Возбудитель кишечного иерсиниоза
Подвижность	-	+	+
Лизис а) индикаторным чумным фагом	+	-	-
б) псевдотуберкулезным фагом	-	+	-
Рост на голодно-кислой среде	-	+	+
Ферментация: рамнозы	-	+	-
маннита	+	+	+
мальтозы	+	+	+
сахарозы	-	-	+
Наличие: уреазы	-	+	+
аденозиндезаминазы	-	+
плазмокоагулазы	+	-	-
фибринолизина	+	-	-
фракции 1	+	-	-
Вирулентность: в S-форме	-	+	+
в R-форме	+	-	-

 

 

Е. Географические разновидности туляремийных бактерий

 

Расы	Ферментация глицерина	Наличие цитруллин-уреидазы	Патогенность для домашних кроликов и людей
Голарктическая раса (Европа, Азия) Francisella tularensis holarctica	-	-	умеренно патогенна
а) японский вариант - var. japonica	+	-	“
Среднеазиатская раса - Francisella tularensismediasica	+	+	“
Неарктическая, или американская раса - Francisella tularensis nearctica	+	+	Относительно высокая патогенность для кроликов и людей

 

 

Ж. Ландшафтные типы природных очагов туляремии

 

Пойменно-болотный, луго-полевой, степной, лесной, предгорно-ручьевой, тугайный (пойменно-пустынный) и тундровый.

З А Н Я Т И Е2

Дата ______________

 

Тема: ООИ. Микробиологическая диагностика бруцеллеза

 и сибирской язвы

План занятия:

1. Приготовление, окраска и микроскопия препаратов-мазков из убитых культур бруцелл.

2. Бактериологическая диагностика бруцеллеза. Выделение гемокультуры (разбор).

3. Серологическая диагностика бруцеллеза. Реакция Райта. Регистрация результатов реакции Райта.

4. Ускоренный метод серологической диагностики бруцеллеза – реакция Хеддлъсона и др.

5. Аллергическая диагностика бруцеллеза. Постановка пробы Бюрне (разбор).

6. Знакомство с препаратами, применяемыми для диагностики, профилактики и лечения бруцеллеза (диагностикумы, бруцеллин, профилактические и лечебная вакцины).

7. Возбудитель сибирской язвы. Изучение морфологических и культуральных свойств. Приготовление и микроскопия мазков из чистой куль­туры авирулентной сибиреязвенной палочки.

8. Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для диагности­ки, профилактики и лечения сибирской язвы (антраксин, вакцины, сыворотки).

 

Методические указания

1. Приготовить, окрасить по Граму и промикроскопировать пре­парат из убитой культуры бруцелл. Обратить внимание на размеры микроорганизмов.

3. Поставить реакцию Райта с сывороткой больного бруцеллезом по классической схеме пробирочной реакции агглютинации (см. Часть I, занятие 16). Диагностический титр реакции Райта - 1:200.

Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на на­личие заболевания бруцеллезом у данного больного?

Регистрация результатов реакции Райта

Разведения сыворотки	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	Контроль
Результат реакции

 

Вывод: ______________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

 

4. На стекле размечают карандашом 4 квадрата размером 3x3 см каждый. Микропипеткой наносят в квадраты капли сыворотки объемом 0,04, 0,02 и 0,01 мл, в последний квадрат одну каплю (0,03 мл) физиологического раствора (контроль). В каждую каплю другой микропипет­кой добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума. Перемешивают капли стеклянной палочкой пли петлей, начиная с контрольной капли и идя от меньших количеств сыворотки к большим. Слегка подогревая и покачивая стекло, наблюдают за появлением агглютинации, которая должна наступать в течение 5 минут.

Оценка реакции: агглютинация только в первой капле – реакция сомнительная; агглютинация в первой и второй каплях – реакция положительная; агглютинация во всех трех каплях – реакция резко положи­тельная.

Примечание: Реакция Хеддльсона имеет только скрининговое, ориентировочное значение. В случае ее положительного результата необходимо ставить более надежные серологические реакции (Райта, РПГА, ИФМ) и/или аллергическую пробу Бюрне.

Зарисовать реакцию Хеддльсона с указанием доз сыворотки в каждой капле.