Б) Гель фильтрация на молекулярных ситах.

Этот метод позволяет разделять белки с различными молекулярными массами, пропуская их растворы через колонки, наполненные так называемыми молекулярными ситами.

Молекулярные сита – это гранулы различных пористых нерастворимых материалов (полисахариды, синтетические смолы, пористое стекло) (рис. 5-29). Поры в гранулах определённого размера, поэтому молекулы, меньшие чем размеры пор, проникают в них, а более крупные минуют гранулы, не задерживаясь. В результате, более крупные молекулы быстрее пройдут слой молекулярного сита, чем меньшие молекулы, и произойдёт их разделение по величине и молекулярной массе.

 

 

 

 

Рис. 5-29. Схема, показывающая «просеивание» частиц разной величины через гранулы сефадекса

 

 

Растворы, содержащие молекулы белков разной массы, пропускают через колонки, заполненные какими-либо пористыми материалами (например, сефадексом) и по скорости прохождения молекул через колонку определяют приблизительную молекулярную массу белков (рис. 5-30).

 

Рис. 5-30. Принцип действия колонок, заполненных гранулами сефадекса

 

В) Гель-электрофорез.

Этот метод основан на том, что молекулы белков содержат заряженные группы, поэтому они способны двигаться в электрическом поле. Движение частиц в растворителе под влиянием электрического поля и называют электрофорезом. По скорости перемещения макромолекул можно определить их молекулярную массу. В качестве носителя, на который наносят раствор разделяемых молекул, можно использовать ватманскую бумагу, полоски ацетата целлюлозы и гели крахмала, полиакриламида, агарозы и другие (рис. 5-31).

Для разделения белков лучшим носителем служит полиакриамидный гель. Такой гель-электрофорез проводят или в колонках, наполненных гелем или на пластинках геля (рис. 5-32).

 

Пример электрофореза смеси 17 аминокислот. Электрофорез проведен при рН 2,25, в качестве носителя использована ватманская бумага.

 

Рис. 5-31. Разделение смеси аминокислот электрофорезом

Разделение смеси белков электрофорезом на колонке, наполненной полиакриламидным гелем. Электрофорез проведён при рН 7,2. Белки двигались сверху вниз. Фракции белков после электрофореза окрашивали красителем бриллиантовым голубым Кумасси. Названия белка и его молекулярная масса указаны около соответствующей зоны. Быстрее всех двигался самый маленький белок (цитохром с, М=11700)

Рис. 5-32. Результат разделения смеси белков электрофорезом на колонке

 

Форма белковых молекул

В разделе по классификации белка указывалось, что молекулы белков по пространственной конформации можно разделить на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют сферическую или близкую к сферической форму (инсулин, рибонуклеаза, химотрипсиноген, пепсин). Фибриллярные белки существуют в растворе в виде эллипсоидов или палочек (фибриноген крови, миозин мышц).

Определить форму белковых молекул можно с помощью нескольких физических методов. Первый – это определение вязкости раствора при данной концентрации белка. Белки, молекулы которых резко асимметричны, обладают большей характеристической вязкостью, чем белки с такой же молекулярной массой, но сферической формы. Таким образом, по изменению вязкости в зависимости от концентрации раствора можно оценить форму молекул. Вязкость раствора макромолекул является самой простой мерой асимметрии молекул.

Второй метод – это определение способности растворов белка к рассеянию света. Чем более вытянутая форма молекулы (сильнее отличается от сферы), тем более выражена способность растворов к рассеянию света.