Третичная структура белка.

Изучение конформации глобулярных белков с помощью рентгеноструктурного анализа показало, что она значительно сложнее конформации фибриллярных белков и не имеет пространственной ориентации.

Для описания трёхмерной структуры глобулярных белков пользуются понятием третичной структуры белка, под которой понимают компактное расположение полипептидной цепи в пространстве специфичное для каждого конкретного белка.

Первый белок, для которого выяснили третичную структуру, – это миоглобин мышц кашалота. Это небольшой белок с молекулярной массой 16700. Он содержит 153 аминокислотных остатков в одинарной полипептидной цепи, и гем, как небелковый лиганд. Изучал этот белок Дж. Кендрью с помощью рентгеноструктурного анализа.

Белок представляет собой клубок с восемью α-спиральными участками, разделённых между собой местами сгибов (рис. 5-22).

Сейчас изучена третичная структура нескольких сотен белков. Она зависит от ионной силы, рН, температуры раствора, в которой белок находится, и других показателей.

Третичную структуру стабилизируют в основном нековалентные взаимодействиями между функциональными группами радикалов аминокислотных остатков в полипептидной цепи (рис. 5-23). К ним относятся гидро-

Модель третичной структуры молекулы миоглобина на основании данных, полученных рентгеноструктурным анализом с высоким разрешением (0,2 нм). (по Дж. Кендрью)

Рис. 5-22. Глобула миоглобина

 

фобные, водородные, диполь-дипольные и электростатические связи. В местах изгибов цепи возникают ковалентные дисульфидные мостики между радикалами цистеина.

 

Рис. 5-23. Связи, стабилизирующие третичную структуру белков

Основной движущей силой в возникновении третичной структуры белков является взаимодействие радикалов аминокислот с молекулами воды. При этом гидрофобные радикалы погружаются внутрь возникающего клубка, образуя там сухие зоны, а полярные (гидрофильные) радикалы ориентируются наружу, в сторону воды. В результате возникает наиболее термодинамически выгодная конформация молекулы, обладающая минимальной свободной энергией.

Суммируя можно выделить следующие основные особенности третичной структуры миоглобина:

v молекула настолько компактна, что внутри помещается не больше 4 молекул воды;

v все полярные радикалы аминокислот расположены на внешней поверхности глобулы и гидратированы;

v почти все гидрофобные радикалы защищены от контакта с водой, так как расположены в глубине молекулы.

С помощью рентгеноструктурного анализа были исследованы и другие одноцепочечные белки и на рисунке 5-24 приведены модели их структур. На моделях видны отдельные спиральные участки, а также фрагменты с β-складчатой структурой.

 

 

Рис. 5-24. Модели третичной структуры различных белков

 

 

4. Четвертичная структура белков – наиболее сложно организованная структура, характерная не для всех белков.

Большинство глобулярных белков с молекулярной массой больше 50000 Да представляют собой олигомерные структуры, т.е. они состоят из двух или более отдельных полипептидных цепей.

Для таких белков способ расположения в пространстве отдельных полипептидных цепей и формирование единого в структурном и функциональном отношении макромолекулярного образования (нативной конформации) называется четвертичной структурой.

Отдельные полипептидные цепи могут обладать одинаковой или разной первичной, вторичной и третичной структурами и называются протомерами или мономерами белковой молекулы. Сформированное ими образование называется мультимером или олигомером.

Протомеры соединяются друг с другом только нековалентными связями (аналогичными связям в третичной структуре). Каждый протомер в отдельности, как правило, не обладает биологической активностью, и она возникает только при определённом соединении мономеров. Число протомеров в белке чаще всего чётное (2, 4, 6, 8 или больше) (рис. 5-25).

 

Схема строения олигомерного белка, состоящего из 4-х протомеров. Каждый протомер представляет собой полипептидную цепь, образовавшую отдельную глобулу.

 

Рис. 5-25. Модель белка-тетрамера

 

Одним из первых изученных белков с четвертичной структурой является гемоглобин. Он состоит из четырёх полипептидных цепей двух разных типов (α и β) и содержит 4 содержащих железо кофактора (гем) (рис. 5-26).

 

 

Модель строения тетрамера гемоглобина. В модели различаются два типа мономеров. Один тип – β-структуры (тёмные), второй тип – α-структуры (светлые). Указаны два гема, соединённые с кислородом (два диска), другие два не видны.

 

Рис. 5-26. Модель гемоглобина

 

Молекулярная масса таких сложных белков может достигать 100000 Да, хотя есть и более сложные образования как например нуклеопротеиновый комплекс вируса табачной мозаики. Его молекулярная масса – 40 млн Да, количество белковых протомеров нанизанных на цепь РНК – 2130. Весь гигантский нуклеопротеиновый комплекс образуется спонтанно методом самосборки (рис. 5-27). Даже если с помощью специальных методов разъединить молекулу РНК и полипептидные протомеры, то они полностью восстановят исходную структуру при последующем их смешивании.

Модель строения нуклеопротеинового комплекса вируса табачной мозаики. Отдельные мономеры нанизываются на нить РНК, формируя огромный сложный нуклеопротеиновый комплекс.

 

Схема, показывающая, как происходит самосборка комплекса вируса табачной мозаики из молекулы РНК и полипептидных протомеров.

 

 

Рис. 5-27. Схема строения и процесса самосборки рибонуклеопротеинового комплекса вируса табачной мозаики

 

Нековалентные связи в олигомерной структуре образуются между контактными площадками отдельных мономеров, которые взаимодействуют друг с другом по принципу комплементарности. Формирование белков в виде сложных комплексов имеет ряд преимуществ:

v уменьшается вероятность ошибок при синтезе белка;

v экономится генетический материал, на основе которого идёт синтез;

v становятся возможными регуляторные взаимодействия, как в случае регуляторных ферментов.

 

· Физико-химические свойства белков

1. Молекулярная масса белков. Способы её определения

Молекулярная масса белков может очень сильно различаться от нескольких тысяч до сотен тысяч и даже миллионов. Например:

 

§ Цитохром с – 13000

§ Гормон роста человека – 21500

§ Пепсин – 35500

§ Фибриноген – 330000

§ Гемоцианин осьминога –2800000

 

 

 

Молекулярная масса белка зависит от количества остатков аминокислот, образующих её молекулу. Для белков, у которых известен их аминокислотный состав, можно точно рассчитать молекулярную массу, но для большинства её определяют с помощью физико-химических методов.

Наиболее часто используют методы седиментационного анализа, гель-хроматографии и электрофореза.

 

а) Метод седиментационного анализа:

Седиментация – общий термин для обозначения движения в поле центробежной силы. С помощью седиментационного анализа можно получить данные о молекулярной массе (М), плотности и форме молекул.

В 1925 г. Сведберг изобрёл ультрацентрифугу, с помощью которой можно создавать центробежные ускорения в 250 тысяч раз превышающие ускорение земного притяжения (рис. 5-28). Частицы, находящиеся под действием центробежной силы, возникающей при вращении ротора, движутся вдоль действия этой силы с определённой скоростью.

В современных ультрацентрифугах скорость вращения ротора достигает 420000 g. Для поддержания таких скоростей в центрифугах создаётся вакуум и контролируется температура.

 

Рис. 5-28. Устройство ультрацентрифуги

 

 

Скорость осаждения (седиментации) частиц в центрифужной пробирке зависит от:

1. величины центробежной силы

2. размера, формы и плотности частиц

3. плотности и вязкости растворителя.

 

Выражают скорость седиментации через коэффициент седиментации s и измеряют его в единицах, называемых сведбергами (S). 1 S равен 1 · 10^-13 сек.

Чем больше М частицы или молекулы, тем больше коэффициент седиментации s. Для белков коэффициент седиментации s лежит в пределах от 1 · 10^-13 до 200 · 10^-13. Если для частиц определён коэффициент седиментации, то можно рассчитать их молекулярную массу, используя уравнение:

,

где s – коэффициент седиментации, R – газовая постоянная, Т – абсолютная температура в кельвинах, D – коэффициент диффузии, ν – парциальный удельный объём растворённого вещества, ρ – плотность частиц. Все величины в этом уравнении можно определить экспериментально.