Растровый конфокальный микроскоп

Растровый конфокальный микроскоп, схематически изображенный на рис. 3.5, не является чем-то новым, но в последнее время он опять стал широко использоваться, особенно в биологии. Точечный источник, им может быть лазер, фокусируется высококачественным объективом микроскопа L ₁ (не конденсором) на плоскость образца. Линза второго объектива пересылает изображение источника, используя подходящую длину трубы, на приемник D. Так как фокусы обоих объективов расположены в одной плоскости, то ми­кроскоп называется конфокальным. В некоторых приборах перед приемником помещается точечная диафрагма.

Для получения изображения можно просканировать сам предмет, переме­щая его мимо изображения источника. Там, где, например, предмет прозрачен, весь свет от источника фокусируется на приемнике. Там же, где предмет не­прозрачен, приемник получает мало света. Выходной сигнал приемника как функция времени представляет собой одну строку изображения. Затем пред­мет движется вверх и вниз (выходя из плоскости страницы), и таким образом может наблюдаться еще одна строка. Последовательность параллельных, ли­нейных разверток называется растром, т. е. мы можем сказать, что предмет сканируется в общей фокальной плоскости двух объективов для получения ра­стровой картинки. Для некоторых измерений, таких как ширина полоски ин­тегральной схемы, не обязательно получать всю растровую картинку, потому что сканирование одной строки дает достаточную информацию.

Предмет можно увидеть, только если он сканируется очень быстро (и в двух измерениях). Поэтому часто бывает удобнее перемещать изображение точеч­ного источника вдоль неподвижного предмета. При длительных количественных

Рис. 3.5. Конфокальный микроскоп.

измерениях перемещение самого предмета, возможно, даст более точные результаты, но в любом случае для получения информации необходимо ис­пользовать цифровую обработку изображения.

Одним из важных преимуществ растровой конфокальной микроскопии пе­ред обычной микроскопией является возможность ее использования для опти­ческого послойного анализа. Иначе говоря, изображения, находящиеся не в фокусе, невидимы, а растровый конфокальный микроскоп позволяет полу­чить слой за слоем изображения объемных объектов, например, биологических образцов. Пунктирными линиями на рис. 3.5 показан ход лучей, выходящих из точки предмета, не лежащей в фокусе. С некоторым приближением источ­ник можно считать точечным, а точка предмета находится далеко от изобра­жения источника, поэтому освещена она не очень хорошо, и ее изображение, безусловно, получается слабым. К тому же, если перед приемником имеется диафрагма, то изображение точки, не находящейся в фокусе, окажется дале­ко от плоскости этой диафрагмы, и следовательно, на приемник попадет со­всем мало света. В результате точки предмета, находящиеся вне глубины поля объектива оказываются не просто размытыми, а невидимыми. Это становит­ся чрезвычайно важным, скажем, при изучении небольших тусклых структур, находящихся вблизи более яркой структуры, или при изучении относитель­но неплотных структур типа клеток без ограничений, вносимых размытыми изображениями несфокусированного предмета.

В промышленном растровом конфокальном микроскопе сканирование источ­ника (а не предмета) можно осуществлять с помощью перфорированного дис­ка, называемого диском Нипкова. Подобная схема изображена на рис. 3.6. Равномерно излучающий диффузный источник S фокусируется светоделите­лем BS и конденсором CL на вращающийся диск D—диск Нипкова, в ко­тором проделаны дырочки, расположенные в виде дуг спирали, как показано на вынесенной картинке на рис. 3.6. Изображения дырочек проецируются на плоскость предмета с помощью линзы объектива микроскопа МО; движение этих изображений по плоскости предмета создает искомый растр.

Линза объектива возвращает свет, рассеянный или отраженный точками предмета, на диск Нипкова. Оттуда свет через окуляр направляется либо для непосредственного наблюдения глазом, либо на видеокамеру для наблюдения на мониторе или для обработки изображения. На рис. 3.6 промежуточное изо­бражение проецируется в плоскость диска: в свою очередь конечное изображе­ние I появляется в плоскости изображения объектива переноса (или окуляра) RL. Изображение будет устойчивым, если оно сканируется диском менее чем за примерно 1/60 с.

Диск на рис. 3.6 пропускает только очень малую долю падающего на него света. Поэтому источник должен быть очень интенсивным. К тому же диск должен быть хорошо отполирован и наклонен под небольшим углом к направлению

 

Рис. 3.6.Конфокальный микроскоп с диском Нипкова, работающий в реальном вре­мени (G.S. Kino, Intermediate Optics in Nipkow Disk Microscopes, in Handbook of Biological Confocal Microscopy, ed. by J.B. Pawley, Plenum, NY, 1990).

падающего луча, чтобы исключить вклад в изображение света, рассеян­ного диском. Для дальнейшего отделения рассеянного света после источника помещается поляризатор Р. Поляризованный свет от источника дважды про­ходит через четвертьволновую пластинку Q перед возвращением на диск Нипкова. После этого плоскость поляризации поворачива­ется на 90°, и свет направляется через второй поляризатор, или анализатор, А, ось которого повернута на 90° по отношению к оси первого. У рассеянного же света осталась прежняя поляризация, и он, таким образом, не может прой­ти через второй поляризатор. В других схемах, использующих диск Нипкова, вместо поляризаторов могут быть использованы зеркала, которые направляют отраженный свет в отверстия в диске, не используемые для облучения, и таким образом удаляется свет, рассеянный диском.

Растровый конфокальный микроскоп, в котором используется диск Нип­кова, почти всегда работает в режиме отражения. Часто это является пре­имуществом, как, например, когда нужно рассмотреть непрозрачный предмет. В других случаях это неважно или перевешивается способностью прибора де­лать невидимыми плоскости, лежащие не в фокусе.

Разрешение обычного микроскопа или растрового конфокального микроскопа ограничено дифракцией. Это происходит потому, что такие приборы создают изображение каждой точки предмета, и изображения этих точек искажены дифракцией. Предел разрешения определяется радиусом диска Эйри.

Много работ было посвящено построению изображения, предел разреше­ния которого был бы меньше предела Рэлея, но обычно получались более чем скромные результаты. Например, растровый конфокальный микроскоп имеет предел разрешения примерно на 30% меньше предела Рэлея. Уве­личение дифракционно-ограниченных изображений с помощью компьютеров также было малоуспешным.

Растровый оптический микроскоп ближнего поля — это зондовый микро­скоп, в котором изображение воссоздается по точкам без использования линз. Зонд, диаметр которого много меньше длины волны, устанавливается на фик­сированном расстоянии от предмета и используется, например, для регистра­ции отражения от предмета. Пока зонд очень мал и находится близко от пред­мета, предельное разрешение системы приблизительно равно его диаметру.

Зонд может быть изготовлен при помощи нагрева и растяжения оптиче­ского волокна или микрокапилляра до разрыва или еще лучше при помощи заострения конца оптического волокна травлением. В любом случае этот ко­нец с помощью вакуумного напыления покрывается металлом типа алюминия или серебра. Если пар металла будет падать на рабочий конец сзади, то са­мый его кончик окажется в тени источника паров, в результате чего он будет иметь небольшую не покрытую металлом область и сможет использоваться в качестве зонда.

На рис. 3.7 представлена схема типичного растрового оптического микро­скопа ближнего поля. Зонд присоединен к оптическому волокну (не показан­ному на рисунке), через которое на него поступает свет лазера. Зонд распо­лагается вблизи образца подобно тому, как это делается в атомно-силовом и сканирующем туннельном микроскопах (которые не являются оптически­ми микроскопами). В растровом оптическом микроскопе ближнего поля пье­зоэлектрическое устройство вызывает колебания, или «дрожание» зонда на частоте его механического резонанса. Эти колебания регистрируются, напри­мер, с помощью лазерного пучка, направленного перпендикулярно образцу, и последующего наблюдения с помощью фотоприемника за светом, рассеянным зондом. Зонд близко подводится к образцу с помощью пьезоманипулятора, т. е., микрорегулятора, в котором для регулировки положения используется пьезоэлектрический кристалл. Хотя не совсем понятно, как это происходит, амплитуда «дрожания» уменьшается и частота меняется до тех пор, пока зонд не коснется поверхности. С использованием электронной обратной связи для поддержания постоянными амплитуды, частоты или фазы «дрожаний» рабочий

Рис. 3.7. Схематическое изображение растрового оптического микроскопа ближнего поля. С —центр зеркальной полусферы

конец зонда может быть также установлен на фиксированном расстоянии от поверхности, имеющем значения 5 или 10 нм.

Зонд заостряется до размеров, меньших длины волны света и поэтому он работает (или не работает) подобно конусному выходному соединителю п. 12.1.5). Это означает, что большая часть света, направленного на зонд, теряется в результате заострения — некоторая его часть отражается обратно, а другая поглощается металлическим покрытием, которое может быть разру­шено, если входная мощность слишком велика, а именно порядка нескольких десятков милливатт.

Коэффициент пропускания зонда обычно имеет значения между 10^-4 и 10^-6. Обратное пропускание имеет примерно тот же порядок, так что сум­марное отражение системы находится в промежутке 10^-8-10^-12. Поэтому до­статочно трудно (но иногда возможно) измерить отраженную мощность, во- первых потому, что она мала, а во-вторых, потому, что она подвержена воз­действию дробового шума, создаваемого излучением, отраженным острием в обратном направлении.

Вместо этого конструкторы растровых оптических микроскопов ближнего золя часто используют системы, подобные изображенной на рис. 3.7, в ко­торых используется непрозрачный образец, так что система работает на отра­жение. Зонд облучает очень маленькую площадь образца, и свет, отраженный этой областью, дифрагирует во всех направлениях. Для сбора дифрагирован­ного света и фокусирования его на приемник используется полусферическое зеркало. Дифрагированная мощность пропорциональна отражательной спо­собности образца непосредственно под зондом. С помощью сканирования зонда образцом получается изображение поверхности. Если поверхность не плоская, а имеет рельеф, то этот рельеф может быть также промерен при помощи мо­ниторинга расстояния зонда до поверхности.

Существует несколько конструкций растровых оптических микроскопов ближнего поля. Если образец прозрачен, то полусферическое зеркало может быть заменено светосильным объективом, расположенным, например, по дру­гую сторону образца. Так же, как и в первом случае, образец может быть осве­щен, но теперь регистрируется свет, даваемый зондом. Таким же образом может быть измерена структура мод полупроводникового лазера. И наконец, если образец является фотоэлементом типа солнечной батареи, то он мо­жет быть освещен с помощью зонда, при этом результирующий фототок дает информацию о структуре образца.

Когда луч света отражается от металлической поверхности, он слегка про­никает внутрь металл. Интенсивность света внутри металла приближенно является экспоненциальной функцией глубины. Глубина, на которой интен­сивность падает в 1/е раз по сравнению с ее значением на поверхности, назы­вается толщиной скин- слоя. Интенсивность на головке зонда примерно посто­янна вдоль ограничительной апертуры зонда, а затем падает экспоненциально с увеличением радиуса. Таким образом, эффективный диаметр зонда, опять же очень грубо равен диаметру головки зонда плюс двойная толщина скин- слоя.

Обычно толщина скин- слоя меньше диаметра рабочего конца зонда, и по­этому ее величина не имеет значения. Тем не менее, толщина скин- слоя опре­деляет теоретический предел разрешения головки зонда бесконечно малого диаметра. Это означает, что конечный предел разрешения растрового оптиче­ского микроскопа ближнего поля имеет порядок удвоенной толщины скин- слоя металлического покрытия. Толщина скин- слоя зависит от свойств металла и качества его нанесения и имеет величину порядка 50 нм для большинства ме­таллов в видимой области спектра.

Свойства изображения, даваемого растровым оптическим микроскопом ближнего поля, сложным образом зависят от взаимодействия рабочего конца зонда и поверхности. Волна, проходящая через зонд, быстро распространяет­ся после того как она покидает рабочий конец зонда, так что предел разрешения

 

 

Рис. 3.8. Микрофотография алюминиевых полосок на прозрачной

подложке, полу­ченная с помощью растрового оптического микроскопа ближнего поля. Фотография Хельмута Хензела и Армина Кнолля, Байрейтский университет, Германия; любезно представлено Digital Instruments.

 зависит только от расстояния между зондом и образцом. Вследствие многократного отражения также имеется сильное взаимодействие между вол­нами, пришедшими от зонда, и волнами, отраженными образцом. В терминах чувствительность растрового оптического микроскопа ближнего по­ля не является линейной функцией электрического поля, и таким образом этот прибор не может характеризоваться ни импульсной характеристикой, ни пере­даточной функцией. И в самом деле, возможно, из-за сильной нелинейности чувствительности растрового оптического микроскопа ближнего поля его пре­дел разрешения имеет порядок 10 нм, или намного меньше толщины скин-слоя.

На рис. 3.8 изображена микрофотография мишени, полученная с помо­щью растрового оптического микроскопа ближнего поля. Мишень состоит из алюминиевых полосок, нанесенных на стеклянную пластину. Микрофотогра­фия получена в проходящем свете, так что непрозрачные алюминиевые по­лоски выглядят темными. Хорошо разрешенные вертикальные полосы вблизи центра рисунка находятся примерно на расстоянии 30 нм друг от друга; это означает, что предел разрешения прибора несколько меньше 30 нм.

 

Телескоп

Телескоп отличается от микроскопа местоположением предмета и предназна­чен для наблюдения за крупными объектами, находящимися на далеком рас­стоянии. Как и в случае микроскопа, объектив

Рис.3.9. Простой телескоп

телескопа создает изображение, которое затем рассматривается через окуляр.

Пусть предмет расположен на далеком расстоянии, но при этом достаточно велик, чтобы быть видным под углом а с местоположения телескопа (рис. 3.9). Через телескоп он виден под углом а'. Как и в случае лупы, мы определяем угловое увеличение телескопа соотношением

МР= .                                              (3.15)

Из геометрических соображений находим, что а = h ’/ f ’₀  и а' = h'/f’_c. Таким образом,

MP=                                                                                      (3.16)

где знак минус оставлен потому, что изображение перевернуто. Если f'₀ намного больше, чем f ' _e , то удаленный предмет при рассмотрении в телескоп может казаться намного большим, чем при рассмотрении невооруженным глазом.

Принято на примере телескопа демонстрировать роль зрачков и диафрагм в оптической системе. Как и в случае фотоаппарата, отверстие, ограничиваю­щее общее количество света, поступающее в телескоп, называется апертурной диафрагмой, или ограничивающей апертурой. В правильно сконструированном телескопе оправа, в которой крепится объектив, служит апертурной диафраг­мой и приблизительно совпадает с самим объективом.

Теперь проследим за ходом двух пучков лучей в телескопе (рис. 3.10). Луч рг, который проходит через центр апертурной диафрагмы, называется глав­ным лучом. Пучки, выходящие из окуляра, образуют перетяжку, в которой главный луч пересекает ось немного позади F ' _e. Окуляр создает изображе­ние апертурной диафрагмы в плоскости, в

Рис.3.10. Входной зрачок телескопа

которой главный луч пересекает ось. Это изображение называется выходным зрачком и лежит в плоскости пе­ретяжки. Внимательное изучение рис. 3.10 также показывает, что выходной зрачок и перетяжка в точности совпадают. Все лучи, которые входят в апер­турную диафрагму и проходят через оптическую систему, проходят при этом через выходной зрачок. В телескопе апертурная диафрагма также играет роль входного зрачка.

Формально выходной зрачок определяется как изображение апертурной диафрагмы, которое видно во всех частях оптической системы, расположенных после нее. Входной зрачок — это изображение, которое видно во всех частях оптической системы, расположенных перед апертурной диафрагмой. Входной и выходной зрачки также являются изображениями друг друга. Для наилуч­шего наблюдения глаз должен быть расположен вблизи входного зрачка. Ина­че большая часть лучей не попадет в зрачок глаза. Это явление называется виньетированием.

Полагая, что е — диаметр входного зрачка, а е' — выходного, легко пока­зать, что

= М P                                             (3.17)

Для телескопа е также является и апертурной диафрагмой, так что диаметр выходного зрачка составляет 1/МР от диаметра апертурной диафрагмы.

В идеальном случае выходной зрачок должен не только совпадать со зрач­ком глаза по местоположению, но и иметь примерно одинаковый с ним диа­метр. Если выходной зрачок слишком велик, то виньетирование неизбежно, и глаз фактически становится ограничивающей апертурой. Многие лучи, входящие в объектив, не попадают в глаз, и таким образом значительная часть полезной поверхности объектива используется впустую, что можно легко уви­деть, проецируя изображение зрачка глаза в плоскость объектива. В данном случае именно это изображение, а не сам объектив является входным зрач­ком. Тем не менее, некоторые телескопы имеют несколько большие выходные зрачки, чтобы дать глазу некоторую свободу перемещения.

Если угловое увеличение настолько велико, что выходной зрачок становится много меньше зрачка глаза, то полезное угловое увеличение может превысить величину

MP_u=5D _(см)                                                       (3.18)

где D — диаметр объектива в сантиметрах. Для данного D угловое увеличение не должно сильно превышать МР_и .

Мы уже говорили, что зрачок глаза имеет диаметр примерно 5 мм при средних условиях наблюдения (средний глаз). По этой причине большинство биноклей делаются с входными зрачками 5 мм (хотя ночные бинокли могут иметь выходные зрачки до 8 мм). Например, бинокли с семикратным увеличе­нием обычно имеют объективы 35 мм. Такие бинокли маркируются как 7 х 35; первое число означает оптическую силу, второе — диаметр объектива в милли­метрах. Другими распространенными биноклями являются бинокли, имеющие маркировки 8 х 40 и 10 х 50, тогда как ночные бинокли могут быть 6 х 50. Ма­ленькие, легкие бинокли, такие как 8 х 25, имеют меньшие выходные зрачки и наиболее пригодны для использования в дневное время. Восьмикратные би­нокли являются наиболее мощными ручными биноклями.

Кроме апертурной диафрагмы большинство телескопов имеют диафрагму по­ля зрения, расположенную в передней фокальной плоскости окуляра. Как и в случае фотоаппарата, диафрагма поля зрения ограничивает угловое воспри­ятие, или поле зрения. Для предотвращения частичного виньетирования она располагается в плоскости изображения, где лучи сходятся в точку.

Как видно из рис. 3.9, если поле зрения телескопа велико, окуляр может иметь недопустимо большой диаметр. Соответственно полевая линза часто рас­полагается в передней фокальной плоскости окуляра или вблизи нее. Она мало влияет на изображение и перенаправляет расходящиеся лучи на ось. В част­ности, при заданном диаметре окуляра полевая линза может перенаправить главный луч к его краю. Таким образом, самый край поля зрения становится размытым в силу того, что примерно половина лучей проходит сквозь окуляр, а другая — виньетируется.

Большинство окуляров телескопов и микроскопов имеют встроенные поле­вые линзы. Вторая линза в таком окуляре, которую мы до сих пор называли окуляром, называется глазной линзой окуляра. Использование полевой линзы приближает выходной зрачок к глазной линзе окуляра и несколько уменьшает eye relief ¹, или расстояние между глазной линзой окуляра и сетчаткой.

 

Объектив телескопа теоретически может разрешить две точки, если расстоя­ние между их изображениями равно 1,22 λ f ’₀/ D  или более. Это означает, что угловое расстояние между этими двумя точками должно быть больше, чем

a_min =  (3.22)

Рис. 3.10.Угловой предел разрешения телескопа.

Для хорошего разрешения этих двух изображений окуляр теле­скопа должен иметь более высокую относительную апертуру (меньшее число F), чем его объектив. Тогда глаз увидит угловое расстояние

a ' _min = , (3.23)

где МР — угловое увеличение телескопа.

В отличие от фотообъективов объективы телескопов относительно редко имеют числа F, превосходящие F /11. Поэтому вблизи оси отражающие объ­ективы или ахроматические дублеты можно с большой степенью уверенности назвать дифракционно ограниченными.

Угловой предел разрешения глаза составляет примерно 0,3 мрад (1'). Глаз сможет различить две точки только в том случае, если a ' _min будет не мень­ше этого значения. Когда a ' _min  точно равно 0,3 мрад, то говорят о полезном угловом увеличении, которое равно

МР_и = 5D_(см), (3.24)

если Л взято равным 0,55 мкм. Чтобы использовать телескоп в полной мере, его угловое увеличение МР должно быть как минимум равно полезному угловому увеличению МР_и , а для удобства наблюдения может быть сделано даже вдвое большим.

С другой стороны, угловое увеличение телескопа не должно слишком силь­но превосходить полезное увеличение. Когда МР примерно равно МР _u, глаз полностью различает дископодобные изображения в фокальной плоскости объ­ектива. Увеличение МР (например, с помощью увеличения оптической силы окуляра) не даст лучшего разрешения, потому что глаз уже увидел изображе­ние в фокальной плоскости объектива. Однако это увеличит размер точечных изображений на сетчатке. Свет, получаемый объективом от одной точки, рас­пространяется не на один, а на несколько рецепторов. В результате края не будут четкими, а контрастность изображения, особенно мелких деталей станет существенно хуже.

По этой причине угловое увеличение, сильно превышающее МР _u, называет­ся бесполезным (пустым) угловым увеличением и его не следует использовать.

 

Зрительные трубы

Телескоп дает перевернутое изображение. В астрономии это неважно, но в зрительных трубах предпочтительно иметь прямое изображение.

Простейшим телескопом прямого изображения является телескоп Галилея, в котором окуляром служит рассеивающая линза, и он автоматически создает

Рис. 3.11.Зрительная труба, или телескоп прямого изображения.

прямое изображение. В наше время такие оптические системы применяются только в слабых театральных биноклях. Призменные бинокли, или полевые бинокли, являются телескопами прямого изображения, в которых используют­ся две отражающие призмы для того, чтобы повернуть изображение и сделать его прямым.

В оптическом приборе, обычно называемым зрительной трубой, использу­ется оборачивающая линза, которая создавая изображение с единичным уве­личением, переворачивает его (рис. 3.11). И телескоп, и микроскоп могут иметь много объективов переноса изображения, подобных оборачивающей линзе EL, показанной на рис. 3.11. Микроскоп, оснащенный такими линзами, называет­ся бороскопом и может быть использован для осмотра внутренностей длинной полой трубки, подобной стволу пушки. В телескопе редко используется более одной линзы переноса изображения. Исключением является случай, когда эта линза комбинируется с зеркалом или призмой для наблюдения за предметом, не лежащим на линии зрения окуляра; такой прибор называется перископом.

Подобно окуляру в обычном телескопе, оборачивающая линза может стать слишком большой, если велико поле зрения и если фокусная длина объектива О также велика. Чтобы избежать этого, следует поместить полевую линзу FL в плоскость первого изображения или вблизи нее. Так же как и полевая линза в окуляре ЕР, эта линза перенаправляет рассеянные лучи на ось оптической системы, как показано на рис. 3.11. В отличие от полевой линзы в окуляре, в данном случае полевая линза проецирует изображение апертурной диафраг­мы в плоскость оборачивающей линзы. [Полевая линза окуляра не проецирует изображение апертурной диафрагмы в плоскость глазной линзы окуляра, по­тому что тогда допустимое расстояние между глазом и окуляром (eye relief) было бы очень мало.]

Во многих отношениях полевая линза напоминает конденсорную линзу в диапроекторе. Она захватывает лучи, которые при ее отсутствии не попадали бы на оборачивающую линзу, и направляет их прямо на ось оптической систе­мы. Для правильной работы полевая линза должна проецировать изображение апертурной диафрагмы в плоскость оборачивающей линзы. Иначе возникнет виньетирование, о чем уже упоминалось, когда речь шла об окуляре телеско­па. К тому же изображение апертурной диафрагмы должно достаточно хорошо заполнять оборачивающую линзу подобно тому, как изображение нити нака­ливания заполняет проекционную линзу диапроектора.

Всякий раз, когда главный луч пересекает ось оптической системы, созда­ется изображение апертурной диафрагмы, или зрачок. В плоскости зрачка по­чти всегда помещается дополнительная диафрагма, которая имеет диаметр, равный диаметру зрачка, и уменьшает количество рассеянного света без ви­ньетирования.

И наконец, нужно проследить, чтобы линза переноса изображения проеци­ровала изображение полевой линзы на полевую диафрагму, связанную с окуля­ром. Полевая линза и полевая диафрагма должны быть изображениями друг друга. Если это не так, то одна из них становится эффективной полевой диа­фрагмой, подобно размеру зрачка глаза в простом телескопе.