Основные технологии производства ДНК-микрочипов

Производственные технологии и дизайн в наибольшей степени определяют достоинства и недостатки биологических микрочипов, области их применения, ценовые характеристики и общую доступность.

Существуют два принципиально разных подхода к производству ДНК–чипов: синтез ДНК заданной последовательности непосредственно на матрице и иммобилизация на подложке заранее синтезированных олигонуклеотидов химическим путем. Технология синтеза олигонуклеотидов на подложке фотолитографическим путем запатентована и применяется компанией Affymetrix, мировым лидером в области производства ДНК – чипов, контролирующим до 70% их мирового рынка. В основе технологии лежит применение фотолабильной защитной группы для мономерных звеньев ДНК, которая удаляется с концевого остатка синтезируемого на подложке олигонуклеотида при облучении УФ – светом. Достоинством такой технологии является возможность получения чипов с очень высокой плотностью нанесения – до 100 000 точек на 1 см2. Очевидный недостаток метода – сложность и дороговизна процесса.

Технологии химической иммобилизации фрагментов ДНК на твердых подложках начали разрабатываться около 30 лет назад и в настоящий момент продолжают совершенствоваться. Общий принцип иммобилизации биологических молекул – формирование на поверхности подложки и на конце пришиваемого олигонуклеотида пары химических групп, обеспечивающей образование между ними ковалентной связи. Существует огромное количество таких способов, большинство из которых основано на взаимодействии нуклеофильной группы (например, аминогруппы), находящейся на поверхности подложки или привязанной к молекуле олигонуклеотида, с электрофильным агентом, в роли которого могут выступать тем или иным путем активированные карбоновые кислоты, моноэфиры фосфорной кислоты и т.д.

 

Оценка экспрессии генов с помощью ДНК микрочипов (на примере Affymetrix GeneChip)

Наиболее часто ДНК-микрочипы применяются для оценки экспрессии генов. Наиболее популярная платформа для решения этого класса задач - микрочипы Affymetrix GeneChip, использующие короткие последовательности олигонуклеотидов для выявления генов, содержащихся в образце РНК. Присутствие в образце каждого гена фиксируется при помощи совокупности зондов длиной в 25 нуклеотидов каждый. Для улучшения качества эксперимента на чипе размещается несколько копий зондов на каждую рассматриваемую последовательность.

Микрочипы Affymetrix обычно используют от 11 до 20 пар проб на каждый изучаемый ген. Одна компонента таких пар, называемая perfect match probe (PM), в точности комплементарна последовательности соответствующего гена - подразумевается, что именно его РНК будет присоединяться к PM-зонду. Такое присоединение называется специфической гибридизацией. Тем не менее, к зондам могут присоединяться нуклеотидные последовательности и других генов (неспецифическая гибридизация). Для оценки воздействия неспецифической гибридизации используется другие компоненты пары - зонды, называемые mismatch probe (MM). Последовательность нуклеотидов в них совпадает с последовательностью в соответствующих PM-пробах с заменой центрального (тринадцатого) нуклеотида на комплементарный. Соотношение интенсивности свечения PM- и MM-проб изначально использовалось для нейтрализации эффекта неспецифической гибридизации, однако более поздние исследования поставили под сомнение правильность подобного подхода.

 

Полногеномное генотипирование полиморфных локусов с помощью микрочипов высокой плотности (на примере Illumina Human610-Quad BeadChip)

К настоящему времени ведущими производителями (Illumina, Affymetrix, Sequenom и др.) разработаны платформы с микрочипами высокой плотности для генотипирования и анализа экспрессии генов (рис. 30)

Illumina Human610-Quad BeadChip включает более 600 тысяч однонуклеотидных полиморфизмов и маркеров вариации по числу копий генов (CNV). Каждый ОНП (SNP) для биочипа отобран на основании точной о нем информации для повышения эффективности определения ассоциации с заболеванием. В геноме человека более 10 миллионов ОНП и изучение каждого полиморфного локуса в геноме экономически нецелесообразно. Компанией Illumina разработан уникальный рациональный подход к выбору ОНП, который обеспечивает высокое качество данных генотипирования и охват всех необходимых локусов для анализа предрасположенности к заболеванию.

 

 

Рис.30. Чиповые технологии для высокопроизводительного генотипирования

 

В состав биочипов Illumina включен набор ОНП, называемых маркерными или таговыми (tag SNP), которые могут быть использованы в качестве прокси-маркеров (маркеров-представителей) для всех распространенных ОНП (с частотой редкого аллеля ≥ 5%) в геноме. Выбор маркерных ОНП основывается на величине неравновесия по сцеплению (r²) между близкорасположенными полиморфными локусами. Высокий уровень r² между двумя ОНП, указывающий на высокую корреляцию, делает эти ОНП хорошими прокси-маркерами. При максимальном r², равном 1, два ОНП находятся в полном неравновесии по сцеплению и могут служить как абсолютные прокси-маркеры, т.е. нужно генотипировать один ОНП, чтобы узнать генотип другого (The Power of Intelligent SNP Selection (www.illumina.com)). Использование маркерных ОНП дает возможность получить максимальное количество информации, высокий уровень покрытия генома и охват генов, а также уменьшить размер исследуемой выборки без снижения эффективности определения генетической ассоциации. Геномное покрытие определяется как количество ОНП, которые находятся в неравновесии по сцеплению с референсным набором локусов. В качестве референсного набора специалисты компании Illumina используют все ОНП, прогенотипированные в проекте HapMap. По данным компании Illumina, биочип Human610-Quad BeadChip обеспечивает покрытие 89% генома в европейских популяциях (CEU, HapMap), 86% генома - в азиатских (CHB+JPT, HapMap) и 58% генома – в африканских (YRI, HapMap) (при r² > 0.8). Среднее расстояние между маркерами на этом биочипе составляет 4,7 т.п.н., медиана – 2,7 т.п.н.

Технология Illumina’s BeadArray основана на использовании 3-микронных кремниевых микросфер (шариков – beads), которые сами собираются в микролунки или на пучках оптических волокон или на плоских кремниевых пластинах. Каждая микросфера покрыта тысячами копий специфических олигонуклеотидов, содержащих локус-специфические и адресные последовательности, по последним из которых определяется, какой шарик в какую микроячейку встроился.

На первом этапе генотипирования проводится полногеномная амплификация образцов ДНК, после которой ДНК фрагментируется (рис.31). На следующем этапе немеченые фрагменты образцов ДНК гибридизуются с соответствующими 50-нуклеотидными зондами, фиксированными на микросферах чипа. После этого для точной идентификации аллеля к тестируемому нуклеотиду с помощью фермента ДНК-полимеразы присоединяется меченый комплементарный нуклеотид. Двухэтапная детекция аллелей каждого маркера – гибридизация с 50-нуклеотидными зондами и последующая ферментативная детекция нуклеотида обеспечивают высокую селективность и специфичность идентификации аллелей (Infinium® HD DNA Analysis BeadChips (www.illumina.com)).

 

 

Рис. 31. Схема протокола генотипирования с помощью биочипов Illumina Human610 quad BeadChip (Infinium® HD DNA Analysis BeadChips (www.illumina.com).

 

*****

Таким образом, в представленном учебном пособии рассмотрены основные молекулярно-генетические методы изучения наследственных болезней человека. В одной книге невозможно описать все существующие на сегодняшний день методы исследования или представить молекулярно-диагностические протоколы для каждой конкретной формы наследственной патологии. Настоящее учебное пособие дает общие представления о методологии и стратегии проведения молекулярно-генетической диагностики, раскрывает методы, наиболее часто используемые в практике современного исследователя. Предлагаемые протоколы проведения исследований, подробное описание различных методик с иллюстрациами, помогут студентам медико-биологического профиля подготовки, специализирующихся по генетике, успешно освоить молекулярно-генетические методы анализа генома человека.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бочков Н.П. Клиническая генетика. М. 2011. – 592 с.

2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с.

3. Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. Санкт-Петербург. «Специальная Литература». 1997. – 287 с.

4. Дейвис К. Анализ генома. Методы. М. 1990. – 246 с.

5. Епринцев А.Т., Попов В.Н., Федорин Д.Н. Идентификация и исследование экспрессии генов. // Учебно-методическое пособие для ВУЗов. – Воронеж. – 2008. – 63 с.

6. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Н. 2003. – 479 с.

7. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. М. - 2010. – 718 с.

8. Кузьмина Н.А. Основы биотехнологии, 2005 // http://www.biotechnolog.ru/

9. Кулмамабетова Г. Пробоподготовка. Методы выделения ДНК/РНК // Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012, Лекция 9.

10. Меньшикова В.В. Клинико-лабораторные аналитические технологии и оборудование. М. 2007. – 240 с.

11. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / под ред. Н.К. Янковского. – М.: Мир, 2002. – 588 с

12. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / под ред. С.Херрингтона, Дж.Макги. – М.: Мир, 1999. – 558с.

13. Мутовин Г.Р. Клиническая генетика. Геномика и протеомика неследственной патологии: учебное пособие. М. 2010. – 832 с.

14. Мухачева Т.А., Ковалев С.Ю. Прикладная биоинформатика. Спецкурс. УрФУ, г. Екатеринбург. 2012.

15. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М. Наука. 2000. – 830 c.

16. Поляничко А. М. Электрофорез в ПААГ. Методическое пособие. Санкт-Петербург. 2007.

17. Притчард Д.Д. – Наглядная медицинская генетика. – пер. с англ. под ред. Н.П. Бочкова. – М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2009. – 200с.

18. Пузырев В.П., Степанов В.А. Патологическая анатомия генома человека. Н. – 1997. – 224 с.

19. ПЦР в реальном времени / под ред. Д.В. Ребрикова. - М.: Бином., 2009. – 223с.

20. Северин Е.С. Биохимия: Учебник. М. 2004. – 784 с.

21. Сукачев М. Современные методы полногеномного секвенирования (расшифровки) ДНК в диагностике и лечении заболеваний // http://innoros.ru/publications/articles/13/

22. Телков М. PCR реального времени: методические основы, оптимизация, применение. Bio-Red Laboratories.

23. Теоретические основы полимеразной цепной реакции. НПО «ДНК-Технология» - Москва, 1998 // www.dna-technology.ru

24. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высоко-эффективная жидкостная хроматография. Основы теории. Методолгия. Применение в лекарственной химии.

25. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA// methods in molecular biology / ED. Walker J.M. – N.Y.: Haman press. – 1984. – P. 31–34.

26. Nolan T, Hands RE, Bustin SA (2006). «Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.». Nat. Protoc. 1: 1559–1582. DOI:10.1038/nprot.2006.236. PMID 17406449.

27. VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM (2008). «Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis». Biotechniques 44: 619–626. DOI:10.2144/000112776. PMID 18474036.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение 1.

Приготовление рективов для выделения ДНК