SSCP (Single-stand conformation polymorphism) - анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК – метод регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых ДНК, различающихся вследствие мутаций по пространственной организации (конформации) молекул.
Конформация небольших однонитевых ДНК зависит от состава нуклеотидов, поэтому замена даже одного нуклеотида приводит к изменению пространственной структуры (рис. 32).
Этапы SSCP-анализа:
1) Выделение ДНК.
2) ПЦР необходимого фрагмента ДНК.
3) Проверочный гель-электрофорез в 7% ПААГ.
4) Денатурация продуктов ПЦР.
5) Электрофорез в 8 (10)% ПААГ с глицерином.
Рисунок 32. SSCP-анализ, обнаружение мутации в гетерозиготном состоянии.
1) Выделение ДНК описано в главе 1.2.
2) Методика ПЦР представлена в главе 2.1.
3) Методика электрофореза в 7% ПААГ описана в главе 3.
Проверочный гель-электрофорез проводят как для детекции ПЦР-продукта, так и для определения его концентрации (по интенсивности свечения в ультрафиолетовом свете).
Для проверочного геля в лунки наносят 4–5 мкл амплификата, смешанного с 2 мкл краски. Электрофорез проводят при напряжении 280–300 В, в течении 20–30 минут. Окрашивают бромистым этидием. Если в ультрафиолетовом свете визуализируются яркие и толстые полоски (высокая концентрация), то для SSCP используют 4 мкл амплификата; при средней концентрации (пример – рисунок 3) для SSCP используют 7 мкл амплификата.
4) Для денатурации продукт ПЦР смешивают с щелочной денатурирующей смесью (5М NaOH и 0,5М ЭДТА) в соотношении 7 мкл амплификата: 3 мкл смеси (Приложение 5). Полученную смесь нагревают в течение 15 минут при 42оС в термостате.
5) К пробам добавляют 3-4 мкл формамидной краски (без ЭДТА), смешанной с 0,5% бромфеноловым синим и 0,5% ксиленцианолом, и наносят на 8(10)% ПААГ с 50%-ным глицерином (Приложение 5).
Эппендорфы помещают в термостат сразу после добавления денатурирующей смеси. После денатурации к смеси добавляется краска и готовые образцы раскапывают в ячейки геля для проведения SSCP-анализа.
Для проведения SSCP-электрофореза используют 0,5хТВЕ буфер (50 мл ТВЕх10 + 950 мл Н2О). Электрофорез геля длиной 20 см и толщиной 1 мм проводят при температуре 4–200С, при напряжении 100 В, в течение 24-48 часов.
Окраску геля проводят в течение 25 минут 0,09% раствором азотнокислого серебра (AgNO3). Методика окрашивания представлена в главе 2.3.
Образцы ДНК с обнаруженным изменением подвижности в дальнейшем секвенируют для выявления локализации мутации. Ограничением метода является размер исследуемого фрагмента ДНК, так как высокая эффективность детекции мутаций до 90% показана при длине фрагментов менее 200 п.н., а для фрагментов более 400 п.н. вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.
СЕКВЕНИРОВАНИЕ
Секвенирование (англ. sequence – последовательность) - метод определения последовательности нуклеотидов исследуемой ДНК.
Исторически открыты два основных метода секвенирования: – Максама-Гильберта (химическое расщепление ДНК по одному основанию) и дидезоксисеквенирование – метод Сэнгера.
В связи со сложностью и дороговизной химический метод Максама-Гильберта в настоящее время практически не используется.
Дидезоксисеквенирование по Сэнгеру – метод определения последовательностей нуклеотидов ДНК путем получения комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание с использованием дидезоксинуклеотидов и радиоизотопов или флюорохромных красителей.
Исторически метод Сэнджера проводился с использованием радиоизотопов. Суть метода заключалась в следующем. Вначале ДНК денатурируют. Затем добавляют секвенирующий праймер, проводят отжиг праймера и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и дезоксинуклеотидтрифосфаты – dATP, dCTP, dGTP, dTTP, один из которых радиоактивен. Синтез ведут в четырех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических дидезоксинуклеотидтрифосфатов, или терминаторов– ddNTP. При встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается (рис.33).
Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различающихся по длине радиоактивно меченых фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминатором на конце молекулы.
После одновременного электрофоретического разделения этих фрагментов на четырех соседних дорожках и радиоавтографии размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит, определена и локализация ddNTP, и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК.
В настоящее время метод секвенирования с использованием радионуклидов не применяется. Используется метод автоматического секвенирования при помощи присоединенных к каждому из ddNTP четырех разных флюоресцентных маркеров (рис. 34).
Рис. 33. Схема секвенирования по Сэнгеру [Жимулев, 2003].
Рисунок 34. Схема автоматического секвенирования [Мухачева, 2012].
Синтез ДНК проводят в одном сосуде, после чего продукты флюоресцентной реакции пропускают через электрофорез в тонком стеклянном капилляре. Проходя через отверстие в капилляре, они возбуждаются лазерным лучом и начинают флюоресцировать. Это регистрируется на цифровую камеру, превращается в электрический сигнал и выводится в виде графика. Используется автоматический секвенатор фирмы Applied Biosystems.
Программа для считывания последовательностей нуклеотидов по результатам автоматического секвенирования – Chromas.
На рис. 35 представлена идентификация нонсенс-мутации при помощи секвенирования – в области замены нуклеотида определяется дополнительный пик другого цвета, характерного для нуклеотида, на который происходит замена.
 |
Рисунок 35. Выявление транзиции методом SSCP и секвенирования.
При обнаружении делеции происходит резкое изменение графика считывания нуклеотидных последовательностей с того нуклеотида, где начинается данная делеция. Анализируя два наслаивающихся друг на друга графика можно определить, какие нуклеотиды делетированы (рис.36).
Рис. 36. Идентификация мутации сдвига рамки считывания методом SSCP и секвенирования.
В процессе секвенирования матричная ДНК должна все время оставаться строго однонитевой, без возможных «шпилек». При комплементарном синтезе по методу Сэнгера такая опасность не возникает, так как в каждом цикле имеется стадия предварительной полной денатурации при температуре 960С, а само копирование осуществляется при температуре 600С. Но электрофорез приходится проводить в денатурирующей среде: 80%-ном растворе формамида, содержащим 5мМ раствор ЭДТА.
Реакцию ограниченного матричного синтеза повторяют многократно. Это делается точно так же, как в ПЦР. Но с тем отличием, что используется только один праймер («асимметричная ПЦР-реакция»). Этап элонгации заканчивается по достижении конца матрицы.
Готовят 20 мкл инкубационной смеси:
1) ДНК секвенируемого фрагмента;
2) избыточное количество 4-х dNTP;
3) ограниченное количество 4-х флюоресцентных ddNTP;
4) Taq-полимераза;
5) буфер с MgCl2;
6) праймер;
7) H20.
Инкубационная смесь прогревается предварительно в пробирке емкостью 200 мкл при 960С для полной денатурации ДНК. Затем ее помещают в термоциклер, где автоматически осуществляется 25 последовательных циклов, каждый из которых состоит из следующих стадий: - 10 секунд при 960С;
- 5 секунд при 500С;
- 4 минуты при 600С.
Во избежание флюоресцентного фона смесь очищают от неиспользованных меченых ddNTP. С этой целью новосинтезированные отрезки ДНК осаждают добавлением 1 мл 70% этанола и центрифугированием в эппендорфах на 1,5 мл. Осадок растворяют в 4 мкл 80% формамида с ЭДТА, прогревают при 960С 2 минуты и в количестве 2 мкл вносят на старт трека ПААГ.
