ПЦР в режиме реального времени

В последнее время широкое распространение получили различные модификации метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Активно внедряется высокочувствительный и высокоспецифичный метод ПЦР «в реальном времени» (или количественная ПЦР, англ. Real-time PCR, qPCR), основанный на регистрации результатов ПЦР во время реакции. Метод ПЦР «в реальном времени» включает в себя одновременную детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий, либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце.

Метод использует общие принципы ПЦР, его основным отличием является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Часто ПЦР «в реальном времени» комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения малых количеств мРНК, что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани.

ПЦР «в реальном времени» использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР «в реальном времени» позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен детектировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

Для количественного определения используют два метода — флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК и модифицированные дезоксинуклеотиды, которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Для проведения ПЦР «в реальном времени» используют детектирующие ПЦР–амплификаторы, способные регистрировать уровень флуоресценции внутри реакционной пробирки через прозрачную крышку или дно пробирки.

 

 

Принципы ПЦР в «реальном времени»

ПЦР «в реальном времени» - это семейство методик количественного ПЦР со следующими чертами:

1. Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации.

2. Построение по этим данным кинетической кривой ПЦР.

3. Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.

4. Автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.

Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР, использование математических методов анализа позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм.

Для детекции ПЦР-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа ПЦР «в реальном времени».

Кинетическая кривая ПЦР в координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму (Рис. 5). В ней можно выделить три стадии:

1. Стадию инициации (когда ПЦР-продукты еще не детектируются флуоресцентной меткой).

2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР).

3. Плато (стадию насыщения).

Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением:

P_n = P₀ * E ⁿ (1)

где P_n - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P₀ - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта.

 

Рис. 5. Кинетические кривые ПЦР «в реальном времени»

Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду:

 

n = - (1/log E) * log P₀ + log P_n /log E (2)

Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция P_C(T)=const. Для n=C(T) уравнение 2 принимает вид:

C(T) = - (1/log E) * log P₀ + log P_C(T) /log E (3)

Т.е. значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата. Таким образом, ПЦР «в реальном времени» позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

 

Различные типы ПЦР «в реальном времени»

Типы ПЦР «в реальном времени» различаются по способам генерации репортерной флуоресценции. Существует два основных способа визуализации накопления ДНК в ходе ПЦР. Оба способа основаны на использовании флуорофоров – молекул, обладающих способностью к флуоресценции (поглощению энергии света определенной длины волны и переизлучению ее на длине волны с меньшей энергией).

Два основных принципа:

1. Применение интеркалирующих флуоресцентных агентов, флуоресценция которых значительно возрастает при связывании с двуцепочечной ДНК.

2. Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку ПЦР-продукта. В качестве интеркалирующего красителя наиболее часто используют SYBR Green. В технологиях TaqMan, Molecular Beacons и LightCycler используют меченые олигонуклеотидные пробы.