2. Освоение методов обработки материалов для вирусологического исследования, взятых от больных (носоглоточные смывы, испражнения и т.д.). Обязательными этапами этой обработки являются эмульгирование материала в растворе Хэнкса с последующим центрифугированием, отсасыванием надосадочной жидкости и добавлением к ней различных антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, нистатин) для угнетения сопутствующей микрофлоры.
3. Освоение этапов приготовления первично-трипсинизированной культуры ткани. Изучить этапы приготовления однослойной. трипсинизированной культуры клеток фибробластов человека. Кусочки эмбриональной ткани измельчить ножницами, пропипетировать в растворе Хенкса, поместить в пробирку, профильтровать. К осадку добавить раствор Хэнкса с трипсином. Перемешать осевшие дезагрегированные клетки, перенести на предметное стекло, изучить морфологию живых клеток в препарате "раздавленная капля", подсчитатьих количество в камере Горяева и внести в пробирку со средой 199 для получения монослоя клеток. Пробирки помещаются в термостат при 370 С на сутки для выращивания.
Изучение клеточных культур производится микроскопическим методом. Для этого пробирка помещается на предметный столик микроскопа; монослой клеток должен быть обращен вверх. Микроскопия проводится с вогнутым зеркалом под малым увеличением микроскопа, конденсор опускается вниз. В пробирке виден сплошной рост одноядерннх клеток в виде одного слоя.
4. Освоение методов культивирования вирусов на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) - заражение РКЭ в амниотическую, аллантоисную полости, на хорион-аллантоисиую оболочку.
Заражение в хорион-аллантоисную полость. Над отмеченным при овоскопии воздушным мешком производят обработку скорлупы спиртом, водой, затем снова спиртом. При закрытом способе заражения в аллантоисную полость в скорлупе над воздушным мешком делают отверстие стерильной иглой. В него вводят иглу шприца, при этом прокалывается хорион-аллантоисная оболочка и игла погружается в аллантоисную полость на I - 2 мм (от поверхности скорлупы расстояние около 1,5 см), после чего вводят 0,2 мл исследуемого материала. Отверстие в скорлупной оболочке закрывают стерильным парафином.
Заражение на хорион-аллантоисную оболочку. После дезинфекции скорлупы последняя отрезается по краю воздушного мешка, дно которого выстлано белой кожистой подскорлупной оболочкой. Ее удаляют стерильным пинцетом, соблюдая осторожность, т.к. под ней расположена прозрачная, влажная, с развитыми сосудами хорион-аллантоисная оболочка, на которую наносят исследуемый материал. Дефект в скорлупе закрывают стеклянным колпачком или пластинкой, края которых предварительно погружаются в расплавленный парафин.
После заражения обоими способами эмбрион маркируют и помещают в термостат.
5. Экспресс-диагностика вирусных инфекций (обнаружение вируса или его компонентов в клиническом материале, взятом от больного – демонстрация).
· исследование мазков-отпечатков с целью обнаружения внутриклеточных включений. Микроскопия мазков-отпечатков с поверхности герпетических язв (окраска по Романовскому-Гимза). Обратить внимание на наличие гигантских многоядерных клеток с внутриклеточными включениями.
· исследование мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей у больного гриппом иммунофлюоресцентным методом. Обратить внимание на светящиеся частицы, располагающиеся внутри клеток.
· обнаружение антигенов вируса герпеса в клиническом материале твердофазным иммуноферментным методом.
· молекулярная гибридизация (выявление вирусов, не размножающихся в культуре клеток или персистирующих вирусов - цитомегаловирусов, вирусов герпеса, энтеровирусов, ро-тавирусов и т.д.). Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей вирусов с формированием двунитчатых структур. Наличие комплементарных нитей выявляют с помощью зондов, которыми являются ДНК и РНК, меченые ферментом. При добавления субстрата к зонду с ферментом происходит цветная реакция.
После изучения темы студент должен знать: классификацию вирусов, их основные свойства, методы культивирования вирусов и экспресс-диагностики вирусных инфекций.
Изучив тему, студент должен уметь: заражать и вскрывать куриные эмбрионы, трактовать данные экспресс-диагностики вирусных инфекций.
Тема 13. ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ: ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. ИНДИКАЦИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ.
Цель занятия: разбор теоретических основ общей вирусологии (репродукция и генетика вирусов, особенности вирусных инфекций и противовирусного иммунитета);знакомство с методами индикации и идентификации вирусов, серологическими реакциями, применяемыми для диагностики вирусных инфекций.
