Метод постановки реакції гемаглютинації

Сутність методу полягає у здатності вірусу хвороби Ньюкасла аглютинувати еритроцити курей.

Для проведення дослідження застосовують додаткову апаратуру: мікротитратор Такачі; дошки з плексигласу.

Проведення дослідження. Готують дворазові розведення вірусовмісного матеріалу від 1: 2 до 1: 1024. Для цього в ряд лунок планшетки з плексигласу (або пробірок) наливають фізіологічний розчин в об’ємі 0,2 см³. Потім в першу лунку вносять 0,2 см³, вірусу, трикратно піпетують і переносять 0,2 см³ суміші в другу лунку і так далі, до необхідного розведення. З останньої лунки 0,2 см³ суміші видаляють у дезінфікуючий розчин (1 %‑вий розчин гідроксиду натрію).

У кожну лунку додають по 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії курячих еритроцитів. Планшети з лунками струшують залишають за кімнатної температури на 30 хв.

Контролем реакції служать дві лунки (пробірки) з еритроцитами і фізіологічним розчином у рівних об’ємах, по 0,2 см³ кожного. РГА також можна ставити мікротитратором Такачі в об’ємі 0,025 см³ в планшетах з лунками.

Обробка результатів. Утворення на дні і стінках лунок (пробірок) осаду еритроцитів у вигляді перекинутої «парасольки» свідчить про позитивну РГА.

За негативної реакції в досліді і контролі еритроцити утворюють на дні лунок (пробірок) диск з рівними краями.

Титром вірусу вважається граничне розведення, за якого спостерігається повна аглютинація еритроцитів, що відповідає 1 гемаглютинувальної одиниці (1 ГАО).

2.3. Метод ідентифікації вірусу

Сутність методу полягає у здатності специфічних антитіл нейтралізувати гемаглютинуючу здатність вірусу в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) з еталонними специфічними сироватками до вірусу хвороби Ньюкасла і типування антитіл у сироватці крові хворої, перехворілої або підозрюваної у захворюванні птиці з еталонними діагностичними антигенами вірусу хвороби Ньюкасла. Для диференціації в реакцію вводять сироватку проти вірусу грипу птиці.

Для проведення дослідження застосовують додаткову апаратуру та реактиви: апарат Кіппа; баню водяну; кислоту соляну 30 %‑вий розчин; крейду; набір діагностичний спеціальний, який містить по одній ампулі (флакону) сухого еталонного антигену вірусу хвороби Ньюкасла та грипу птиці (по 1 см³ антигену в кожній розфасовці) і по одній ампулі (флакону) специфічної імунної сироватки до вірусу хвороби Ньюкасла і вірусу грипу птиці (по 1 см³ сироватки в кожній розфасовці); сироватки імунні, які готують наступним чином: вміст ампули (флакона) зі специфічною сироваткою розводять 1 см³ фізіологічного розчину.

Антиген готують наступним чином: ампули (флакони) з антигенами розводять фізіологічним розчином (рН 7,2‑7,4) до початкового об'єму висушеного вірусу, тобто додають 1 см³ фізіологічного розчину.

Підготовка до дослідження. Для отримання робочої дози вірусу (4 ГАО) зразок ембріональної рідини або антигену розводять фізіологічним розчином у стільки разів, скільки отримують від ділення на 4 цифри, що вказує гемаглютинуючий титр вірусу.

Наприклад, якщо титр гемаглютинації 1: 256, то робоче розведення буде 256: 4 = 64. Для його приготування необхідно взяти 63 см³ фізіологічного розчину і 1 см³ вихідного вірусу. Розведений 1: 64 вірус буде містити 4 ГАО.

Перед постановкою основного досліду перевіряють правильність вибору 4 ГАО. Для цього беруть п'ять лунок; в першу і другу наливають по 0,2 см³ вірусовмісного 4 ГАО, після чого в другу, третю, четверту і п'яту лунки наливають по 0,2 см³ фізіологічного розчину. Після піпетування з другої лунки переносять 0,2 см³ суміші в третю і так далі. З п'ятої лунки видаляють 0,2 см³ в дезінфікуючий розчин. Таким чином в другій лунці залишається 2 ГАО, у третій 1 ГАО, у четвертій - 0,5 ГАО, а в п'ятій ‑ 0,25 ГАО. Після цього в кожну лунку додають по 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів, дошки струшують і залишають на 30 хв за кімнатної температури.

При правильному виборі робочої дози (4 ГАО) в першій, другій і третій лунках повинна бути повна аглютинація, а в четвертій і п'ятій лунках аглютинації не повинно бути.

Якщо в четвертій лунці виявляється часткова або повна аглютинація, то це означає, що обрана доза вірусу містить не 4 ГАО, а більше. У цьому випадку доза повинна бути зменшена. Особливо важливо, щоб в третій лунці, де повинна бути 1 ГАО вірусу, була повна аглютинація. Якщо в ній аглютинація неповна, то обрана робоча доза містить менше 4 ГАО і повинна бути збільшена.

Для приведення робочої дози до 4 ГАО додають відповідно фізіологічний розчин або вірус і повторно перевіряють величину робочої дози вірусу.

Проведення дослідження. Для постановки основного досліду в ряд лунок, починаючи з другої, наливають по 0,2 см³ фізіологічного розчину. Потім в першу і другу лунки додають по 0,2 см³ приготовленої специфічної сироватки. У другій лунці піпетують і переносять 0,2 см3 суміші в третю лунку і так далі до необхідного розведення. Після цього в усі лунки вносять по 0,2 см³ робочого розведення вірусу (4 ГАО). Дошки струшують і після 30 хв контакту сироватки з вірусом в кожну лунку додають по 0,4 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів.

Для точності обліку РЗГА ставлять контроль:

- сироватки - для виключення присутності гемаглютинінів до курячих еритроцитів (0,2 см³ сироватки, 0,2 см³ фізіологічного розчину і 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів);

- стандартних діагностикумів (0,2 см³ 2 ГАО антигену, 0,2 см³ гомологічної йому сироватки і 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів);

- еритроцитів - на спонтанну аглютинацію (0,2 см³ фізіологічного розчину і 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів).

Облік результатів проводять візуально через 20‑30 хв після осідання еритроцитів у контролі.

Обробка результатів. РЗГА вважають позитивною, якщо специфічна сироватка до вірусу хвороби Ньюкасла повністю затримує гемаглютинуючу активність вірусу (дослідного штаму) не менше ¼ до ⅛ її гомологічного титру.

Метод титрування вірусу

Сутність методу полягає у визначенні титру вірусу на ембріонах курей.

Для проведення дослідження застосовують додаткові матеріали: ембріони курей 9‑10‑добового віку від птиці, вакцинованої вакциною з групи лентогенних штамів не менше ніж за 3 міс до збору інкубаційних яєць.

Підготовка до дослідження. Готують 10-кратні розведення вірусу наступним чином: у 10 стерильних пробірок наливають по 9 см³ стерильного фізіологічного розчину. Потім в першу пробірку вносять 1 см³ вірусу ‑ отримують розведення 10^-1. Потім новою піпеткою після 3-разового перемішування вмісту в першій пробірці відбирають 1 см³ і переносять у другу пробірку. Так готують і наступні розведення до 10^-1 включно, використовуючи при цьому на кожне розведення, окрему градуйовану піпетку.

Проведення дослідження. Приготованими 10-кратними розведеннями вірусу інокулюють по п'ять курячих ембріонів у дозі 0,1 см³ і інкубують упродовж 144 год. Овоскопію проводять кожні 12 год, при цьому ембріони, загиблі в перші 24 год, не враховуються.

Через 144 год інкубації всі ембріони охолоджують за 4 ^оС упродовж 16‑18 год і з ембріональною рідиною заражених ембріонів ставлять РГА.

З ембріонів (що загинули і вижили) беруть до уваги тільки ті, які дали позитивну РГА.

Обробка результатів. Обчислення ЛД₅₀ для курячих ембріонів проводять по метолу Ріда і Менча.

2.5. Метод визначення вірулентності вірусу

Сутність методу полягає у визначенні вірулентності вірусу для курячих ембріонів.

Проведення дослідження. Типування вірусу проводиться визначенням середнього часу загибелі 9‑10‑добових курячих ембріонів, викликаної мінімальної летальною дозою.

Для проведення дослідження використовують розведення 10^-1, 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10.

Кожним з цих розведень інокулюють по п'ять ембріонів 9‑10‑добового віку в алантоїсну порожнину в двох повторностях з розривом у зараженні 12 год, тобто заражають в 8 годин ранку по п'ять ембріонів, кожним із зазначених розведень та у 20 годин ці ми ж розведеними знову по п'ять ембріонів. Заражені ембріони овоскопують щодня через 8 год: у 8 годин ранку та 16 годин, реєструючи час загибелі кожного ембріона упродовж 12 год.

Обробка результатів. Мінімальною летальною дозою (МЛД) вважають найбільше розведення, що викликає загибель всіх інокульованих ембріонів. Середній час загибелі (СЧЗ) обчислюють діленням суми годин загибелі всіх ембріонів, викликаних мінімальною летальною дозою, на число ембріонів. У велогенних штамів середній час загибелі (СЧЗ) становить до 60 год, у мезогенних штамів - від 60 до 90 год, у лентогенних штамів - понад 100 год.