1. Декальцинация. Применяется по отношению к плотным тканям (кость, зуб). Цель – извлечение солей извести. Вследствие этого объект становится мягким и пригодным к резке. Декальцинация всегда производится после фиксации. Объект помещают в 2-10% раствор азотной кислоты на несколько дней.
2. Импрегнация. Метод отложения солей тяжелых металлов на каких-либо структурах с целью их выявления. Применяют соли серебра, золота. Этот метод применяется для выявления нервных волокон, аргирофильных волокон (ретикулярных, преколлагеновых), клеточных границ, комплекса Гольджи.
3. Гистохимические методы исследования проводят с целью выявления содержания и локализации химических веществ, входящих в состав тканей, постановкой химической реакции непосредственно на срезе ткани. В результате реакции взаимодействия искомых групп или элементов исследуемого вещества с реактивом получается специфическое окрашивание. Пользуясь специальными реактивами, можно выявить аминокислотный состав белков, выявить наличие нуклеиновых кислот (ДНК, РНК), определить наличие микроэлементов, ферментов и т. д.
Например: для выявления трехвалентного железа ткань обрабатывают свежеприготовленной равной смесью 2% ферроцианида калия (желтая кровяная соль) и 2% соляной кислотой.
Участки, в которых локализуется трехвалентное железо, окрашиваются в синий цвет (берлинская лазурь).
Гликозаминогликаны (ГАГ) дают реакцию метахромазии – изменение основного цвета красителя при взаимодействии его с искомым веществом. При окрашивании толуидиновой синью, тионином (красители синего цвета) ГАГ дают вишнево-красную окраску. ДНК выявляется реакцией Фельгена, РНК – реакцией Браше, углеводные соединения – ШИК-реакцией и т.д.
Цитохимия - сочетание гистохимических методов с методом электронной микроскопии – позволяет изучать локализацию химических веществ на субклеточном и молекулярном уровнях.
4. Иммуноцитохимический(иммунофлюоресцентный) метод – основан на реакции антиген-антитело. Каждая клетка организма имеет специфический антигенный состав. Антитела обладают высокой специфичностью в отношении антигенов, что позволяет использовать их для выявления специфических белков. Антитела окрашивают флюоресцирующими красителями и после свзывания их с определенной структурой, препарат изучают в люминесцентном микроскопе.
Антитела можно использовать для изучения антигенных структур на ультрамикроскопическом уровне. Для этого антитела метят электронно-плотными частицами, например коллоидным золотом.
Авторадиография.
Меченые атомы широко используются в цитологии для изучения химических процессов в клетке. Например: для изучения биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, проницаемости оболочки, локализации веществ в клетке и т. д.
Для этого используются соединения, в которые введена радиоактивная метка. В молекуле меченого вещества, например, аминокислоты или углевода, один из атомов замещается атомом того же вещества, но радиоактивного, т. е. радиоактивным изотопом. Благодаря тому, что эти атомы ведут себя в организме также, как и не обладающие радиоактивностью, но при этом испускают радиоактивные лучи, их можно легко обнаружить, применяя фотографический метод.
В цитологии используются изотопы водорода – тритий 3Н, изотоп углерода – 14С, фосфора 32Р, серы 35S, йода и др., которые входят в состав органических соединений. Вводят изотопы в организм животных с пищей, в виде инъекций или же в питательную среду при культивировании тканей. Они включаются в обмен веществ. Доза устанавливается опытным путем и не должна изменять нормальный обмен веществ. Через разные промежутки времени после введения меченых веществ фиксируются кусочки тканей и органов (смесь Кариуа или спирт-уксусная кислота 3:1). Из фиксированного материала готовят парафиновые срезы, на поверхность которых после удаления парафина наносят тонкий слой чувствительной и фотографической эмульсии. Эта ядерная эмульсия характеризуется очень мелким размером зерен, их однородностью и гораздо большим насыщением желатина, чем обычная фотографическая эмульсия.
Препараты с нанесенной на них фотоэмульсией экспонируется в темноте при температуре 4 градуса, а потом промываются и закрепляются также, как и обычные фотографии.
Во время экспозиции препаратов изучение радиоактивных изотопов, которые включились в те или иные структуры клетки, оставляет след от пробега радиоакт. частиц в слое фотоэмульсии. В процессе проявления зерна, которые оказались в местах пробега радиоакт. частиц, восстанавливаются проявителем до металлического серебра. Последние имеют черный цвет и выявляются после проявления в виде зерен, которые находятся в слое фотоэмульсии над теми клетками и структурами, в которые включился радиоактивный изотоп. Такие препараты называют радиоактографами. После проявления и закрепления радиоактографы хорошо промывают в воде, а затем окрашивают одним из гистологических красителей.
Контрольные вопросы
1. Методы исследования, используемые в современной гистологии, цитологии и эмбриологии.
2. Витальные методы исследования. Культивирование in vivo и in vitro.
3. Основные принципы приготовления препаратов для световой микроскопии.
4. Этапы приготовления постоянного гистологического препарата.
5. Виды микропрепаратов.
6. Общая характеристика и классификация гистологических красителей.
7. Гистохимические методы исследования.
8. Сущность метода импрегнации, декальцинирования, авторадиографии.
Вопросы, вынесенные на СРС
1. Основные принципы приготовления препаратов для электронной микроскопии.
2. Количественные методы исследования.
3. Понятие об иммунофлюоресцентном, цитоспектрофотометрическом,
ауторадиографическом методах и их использование.
