Основными этапами приготовления гистологических препаратов являются следующие:
1. Взятие материала.
2. Фиксация.
3. Промывка.
4. Обезвоживание.
5. Заделка в уплотняющие среды.
6. Приготовление срезов.
7. Окраска срезов.
8. Обезвоживание, просветление и заключение среза в канадский либо пихтовый бальзамы для длительного хранения.
1. Взятие материала для приготовления препарата от живого организма (биопсия) или от трупа (аутопсия). Объект не должен превышать 1 см3.
2. Фиксацию объекта производят с целью сохранения структуры ткани либо органа, частичного уплотнения и предохранения от порчи. Учитывая выше изложенное, фиксаторы должны отвечать следующим требованиям:
а) не должны изменять структуры объекта,
б) должны свертывать белки,
в) быть бактерицидными.
Фиксаторы различают простые и сложные.
К простым относятся однокомпонентные: формалин (раствор формальдегида в воде), алкоголь, сулема и др.
К сложным фиксаторам относятся фиксаторы, состоящие из нескольких компонентов. Например: 1. Ценкер-формоловая смесь (сулема, формалин, бихромат калия, вода, сернокислый натрий). Каждый компонент этой смеси улучшает качество другого. Например: сулема является очень хорошим фиксатором, но плохо пропитывает ткани; бихромат калия, наоборот, слабый фиксатор, но зато хорошо пропитывает ткани. В сочетании они дополняют друг друга. 2. Жидкость Карнуа (спирт, формалин, ледяная уксусная кислота). Время фиксации зависит от вида фиксатора, вида и размера объекта и от целей, которые преследует исследователь. Варьирует оно от нескольких минут до нескольких дней и даже месяцев.
3. Промывка делается с целью освобождения от фиксатора. Производят ее в проточной воде (до 1 суток).
4. Обезвоживание производят в спиртах возрастающей крепости (от 60 до 100 градусов), чтобы предохранить ткань от быстрого сморщивания. 100 градусный спирт называется абсолютным. Абсолютная концентрация спирта достигается добавлением к 96-спирту влагопоглотителей: прокаленного медного купороса или окиси кальция.
5. Заделка в уплотняющие среды. После обезвоживания производят заделку объекта в уплотняющие среды. Такими средами являются парафин, целлоидин.
Заделка в парафин. Парафин – это твердое вещество - жировоск.
Предварительно объект из абсолютного спирта переносят в смесь спирта с каким-либо жирорастворителем (ксилол, хлороформ) в соотношении 1:1, а затем в порцию чистого жирорастворителя. После этого объект помещают в насыщенный раствор парафина в жирорастворителе с температурой плавления 37 градусов, называемый в гистологической практике снегоподобной массой. В этом растворе объект следует выдержать до 1 суток. Затем объект на несколько часов последовательно переносят в 2 порции чистого парафина с температурой плавления 54-56 градусов (в термостате). После того как объект достаточно пропитался парафином, формируют парафиновый блок путем заливки объекта чистой порцией парафина в специальной формочке с последующим быстрым охлаждением.
а) парафиновая заливка дает возможность получить тонкие равномерные срезы (2-7 мкм);
б) парафиновая заливка дает возможность получить серию срезов, что необходимо для послойного изучения объекта.
6. Приготовление срезов производят на специальных приборах – микротомах. Различают микротомы: а) санные,
б) швейные (ротационные).
В санном микротоме блок укрепляется неподвижно в объектодержателе, а микротомный нож, проходя над ним, делает срезы. В микротоме есть микрометрический винт, соединенный с объектодержателем. Каждый поворот винта вызывает соответственное перемещение вверх объектодержателя с объектом на заданное расстояние (заданная толщина среза).
В швейном микротоме, наоборот, микротомный нож закреплен неподвижно, а объектодержатель с объектом подвижно.
Полученные парафиновые срезы наклеивают на предметное стекло с помощью яичного белка или легкого подогревания на спиртовке или в термостате.
7. Окраска срезов. Окрашивание срезов производится с целью увеличения контрастности изучаемых структур. Для этого срезы необходимо депарафинировать: удалить парафин погружением стекол в ксилол, а затем избавиться от ксилола последовательной промывкой в спирте и воде.
Краска наносится на срез на несколько минут, затем смывается водой. Обычно используется комбинированная окраска с использованием двух или нескольких красителей, избирательно окрашивающих различные структуры, например: гематоксилин (ядра) + эозин (цитоплазма).
8. Заключение объекта для длительного хранения.
После окрашивания срезы промывают водой, обезвоживают спиртом, спирт удаляют ксилолом, который одновременно делает срезы прозрачными. Затем на срезы наносится капля канадского либо пихтового бальзама, после чего он покрывается покровным стеклом и подсушивается. Такие постоянные гистологические препараты могут храниться в течение длительного времени.
