микробиологического исследования при риккетсиозных инфекциях

План

1. Общая характеристика методы культивированиия риккетсий.

2. Классификация риккетсиозов.

3. Эпидемический и эндемический сыпной тиф.

4. Особенности возбудителей, механизм заражения.

Иммунитет.

РИККЕТСИИ

Общая характеристика и классификация.

Риккетсии (Rickettsia) включены в порядок Rikettsiales,семейство Rickettsiaceae, род Rickettsia.

Общая характеристика.

В соответствии с систематикой Берджи («Определить бактерий», 1974) риккетсии занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами (0,3-04, мкм). По морфологическим свойствам и химическому составу они похожи на бактерии, а по своим физиологическим свойствам они приближаются к вирусам.

Все риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразитами, т.е. живут и размножаются (как и вирусы), только в клетках (цитоплазме и ядре) тканей животных, человека и переносчиков. И не растут на искусственных питательных средах.

Это полиморфные микроорганизмы, имеющие следующие формы:

1. кокковидные – мелкие овоидные, d = 0,5 мкм, часто в виде диплококков;

2. палочковидные – изогнутые короткие, тонкие палочки 1-1,5 мкм с зернами на концах, или длинные 3-4 мкм;

3. нитевидные (мицелярные) – 10-40 мкм, изогнутые, иногда многозернистые нити.

Не образуют спор, капсул, неподвижны!

Хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе, Цилю-Нильсену, грамотрицательны (грам -).

Электронной микроскопией и цитохимическими исследованиями у риккетсий установлено наличие внутренней и наружной оболочки, выполняющей функции стенки состоящей из 3-ех слоев. В цитоплазме риккетсий обнаружены, гранулы типа рибосом (20-70) и вакуолеобразные структуры (6-8 нм в диаметре).

Риккетсии размножаются путем деления кокковидных и палочковидных форм с образованием гомогенных популяций соответствующего типа, а также в результате дробления нитевидных форм с последующим развитием кокковидных и палочковидных образований.

Большая часть риккетсий относится к безвредным микроорганизмам. Около 50 различных видов риккетсий найдено в кишечнике и слюнных железах тлей, клопов, клещей.

Патогенные риккетсии поражают различные виды животных и человека; заболевания, вызываемые риккетсиями, носят название риккетсиозов.

Классификация риккетсий и риккетсиозов:

Группа	Возбудители	Особенности паразитирования	Переносчики возбудителей	Источник инфекции	Наименование заболевания
Сыпные тифы	R.prowazekii     R.typhi	Размножаются в цитоплазме и эн-дотелии сосудов Там же	Платяная и головная вши   Крысиные блохи и вши	Больной человек     Крысы, мыши	Эпидемический сыпной тиф   Эндемический сыпной тиф
Клещевые пятнистые лихорадки	R.conorii     R.sibirica   R.akari	Размножаются в цитоплазме и ядре   Там же   Там же	Собачий клещ     Иксодовые клещи     Гамазовые клещи	Южный собачий клещ   Грызуны (мыши, суслики)     Домовая мышь, черная и серая крысы	Марсельская лихорадка   Североазиатский (сибирский) риккетсиоз   Везикулезный (осповидный) риккетсиоз
Риккетсиозы цуцуга-муши	R.tsutsuga-mushi	Размножаются в цитоплазме	Краснотел-ковые клещи	Грызуны, сум-чатые, насекомые	Лихорадка цуцу-гамуши
Пароксизма-мальный риккетсиоз	Rochalimae quintana	Внеклеточный паразитизм	Платяная вошь	Больной человек и носитель	Волынская (пяти-дневная) лихорад-ка
Ку-риккет-сиоз	Coxiella burnetii	Размножаются в вакуолях и цито-плазме макрофагов	Иксодовые и гамазовые клещи	Многие виды диких и домаш-них животных	Ку-лихорадка (пневмориккет-сиоз)

Возбудитель сыпного тифа

В 1909-1910 гг. Г. Риккетс и Р. Уайллер нашли в крови больных мексиканским сыпным тифом и в зараженных вшах неподвижные мелкие биполярные микроорганизмы. В 1913 г. Чешский ученый С. Провачек обнаружил в плазме и лейкоцитах людей, больных сыпным тифом, овальные и продолговатые тельца, окрашенные по Романовскому-Гимзе. В 1916 г. Г. Х. Роша-Лима на основании своих многолетних исследований пришел к выводу, что сыпной тиф вызывают мелкие полиморфные микроорганизмы, обнаруживающиеся в крови больных и в кишечнике зараженных вшей. В честь первооткрывателей он их назвал риккетсиями Провачека.

Морфология:

Риккетсии Провачека – гантелевидные микроорганизмы, описание - смотри общую характеристику. Средние размеры их 0,3-0,6 мкм. Они хорошо окрашиваются феноловым фуксином в красный цвет. В электронном микроскопе у них выявлена микрокапсула (толщиной 10-12нм).

Культивирование:

Хорошо размножаются при t 25°С в желточном мешке куриного эмбриона.

Используют и другие методы:

1. В куриных эмбрионах по Коксу: материал содержащий риккетсии, вводят в полость желточного мешка → яйца в термостат при 36-37°С на 6-7 дней;

2. Интраназально заражают белых мышей, в легких которых накапливаются риккетсии;

3. По методу Вейгля и Мосинга – платяных вшей заражают взвесью риккетсий путем введения в кишку через анальное отверстие с помощью специальных капилляров.

4. А. В. Пшеничков и Б. И. Райхер – метод культивирования риккетсий на личинках вшей, которых кормят через мембрану кожи трупа дефибринированной кровью.

5. И можно, как вирусы, путем заражения тканевых культур (об этом методе более подробно мы поговорим на следующей лекции).

Методы культивирования риккетсий используют при изготовлении сыпнотифозной вакцины и для получения антигенов для серодиагностики риккетсиозов.

Токсинообразование: термолабильный токсин (эндотоксин), который разрушается при 66°С.

Антигенная структура:

2 антигена:

I Аг: термолабильный, спефический для риккетсий Провачека, корпускулярный, поверхностный растворимый, не обладает видовой специфичностью.

II Аг: термостабильный, общий для риккетсий Провачека и крысиного сыпного тифа. Общий с риккетсиями полисахаридный гаптен имеет протей – (Proteus OXI9, OX2, OXK, OXL). Этот Аг липидополисахаридопротеиновый комплекс.

Резистентность:

В высушенных и неповрежденных вшах риккетсии сохраняются до 30 суток, в сухих фекалиях вшей – до 6 суток. От t 50°C гибнут через 15' и при 100°C – через ½ минуты. Губительное действие на них оказывают все применяемые дезинфицирующие средства.

Патогенность для животных:

Восприимчивы обезьяны, морские свинки, белые мыши.

Эпидемиология:

Сыпной тиф – антропонозное заболевание, источником его всегда является больной человек. Носительства нет. Восприимчивость к заболеванию всеобщая. Дети младшего возраста переносят тиф легче, чем пожилые люди. Характерна сезонность заболевания: февраль-май. Развитию болезни способствуют скученность, антисанитарные условия.

Патогенез:

В 1876 г. О. О. Мочутковский опытами на себе впервые доказал заразность крови людей, больных сыпным тифом. Он высказал предположение, что сыпной тиф передают кровососущие насекомые. В 1909 г. Ш. Николь и соавторами подтвердили это положение на обезьянах и установили передачу сыпного тифа через платяную вошь(Pediculus humanus).

Источник болезни – больной человек, переносчик – платяная вошь. Насосавшись крови сыпнотифозного больного, платяная вошь на 3-10е, чаще 4-5е сутки становится заразной. Риккетсии развиваются при 30°C в кишечнике вшей (в клетках эпителия слизистой оболочки кишечника). В результате накопления риккетсий клетки разрушаются, и возбудители вместе с испражнениями попадают на кожу, платье и т.д. Заражение сыпным тифом происходит не через укус вшей, а при втирании риккетсий, которые выделяются при дефекации на кожу и слизистые оболочки.

Риккетсии Провачека вызывают у людей сыпной тиф, который протекает в виде лихорадочного состояния с розеолезно-петехиальной сыпью. Сыпной тиф относится к кровяным инфекциям. Возбудитель в период лихорадки находится в лейкоцитах, эндотелии сосудов кожи, мозга и других органов. Множественный тромбоз артериальной системы приводит к нарушению питания ткани, гибели клеток, особенно ЦНС. На 1 см² поверхности мозга насчитывается несколько тысяч гранулем.

Патологический процесс обусловлен паразитированием риккетсий Провачека в эндотелии мелких кровеносных сосудов и образованием в них специфических гранулем.

Инкубационный период 12-14 дней, с колебаниями от 1 до 3 недель.

Осложнения при сыпном тифе встречаются редко. Иногда возможны гипостатическая пневмония, пролежни, отиты.

Иммунитет: постинфекционный – прочный!

В последние годы количество повторных случаев возросло. Повторные случаи сыпного тифа представляют собой эндогенные рецидивы первичного заболевания. Повторные случаи сыпного тифа называют болезнью Брилля-Цинссера. Рецидивы наступают после различных неблагоприятных воздействий (заболевания, хирургическое вмешательство, переохлаждение, психические и физические травмы, переутомление, голод), на организм, который в течение длительного времени являлся носителем риккетсий в покоящихся формах в состоянии персистирования.

Болезнь Брилля-Цинссера характеризуется более легким клиническим течением с сохранением наиболее типичных признаков сыпного тифа при отсутствии вшивости.

Лабораторная диагностика:

Материалом для выделения возбудителя при всех видах риккетсиозов служит кровь, взятая у больного из вены в возможно раннем периоде лихорадки.

Обычно используют цитратную кровь или взвесь из растертого сгустка свернувшейся крови. Кроме того, материалом могут служить переносчики, органы зараженных животных.

Применяются:

1. Серологический – основной метод;

2. Биологический;

3. Микробиологический;

4. Микроскопический.

Алгоритм

микробиологического исследования при риккетсиозных инфекциях

I этап:

Серодиагностика → ответ:

§ Реакция агглютинации риккетсий (РАР);

§ РСК;

§ РПГА;

§ ИФА;

§ РН риккетсий сывороткой больного с последующей биопробой.

Биопроба: заражение самцов морских свинок в/брюшинно или интрацеребрально.

 

 

Микробиологическая:

I этап:

а) Введение материала в желточный мешок куриного эмбриона;

б) Заражение тканевых культур.

II этап:

1. Вскрытие животных → препараты из органов, окраска по Здрадовскому, ответ.

2. Препараты из зараженных эмбрионов и тканевых культур, окраска по Здрадовскому и иммунофлюоресцентный метод → ответ.

Серодиагностика:

РАР – в пробирках по 0,5 мл объем: 0,25 мл разведения сыворотки + 0,25 мл соответствующих антигенов, → +37°C 18 часов → учет результата, не встряхивая пробирки. Положительной считается реакция не менее, чем на ++ (незначительное просветление, зернистый осадок) в разведениях 1:40 – 1:80.

РСК – по общепринятой методике; реакция считается положительной при задержке гемолиза не менее чем ++. Условно-диагностический титр 1:160 и выше.

РПГА – с разведениями сывороток от 1:250 до 1:64000 по обычной схеме. Условно-диагностический титр 1:250.

Серологическое дифференцирование первичного (эпидемического) и повторного сыпного тифа (болезнь Брилля):

При 1-ом и повторном сыпном тифе формируются качественно различные иммуноглобулины (Ig): при первичном – Ig М (19 S), при повторном – Ig G (7 S). Дифференцирование Ig М и Ig G антител основано на их различной чувствительности к действию редуцирующих веществ, содержащих свободные сульфгидридные группы (2-меркаптоэтанол, цистеин и др.) Эти вещества вызывают разрыв дисульфидных связей в молекулах

Ig М и их распад на субъединицы, лишенные активности антител. Ig G при этом не изменяются. Параллельно ставят РСК с испытуемой исходной сывороткой и обработанной 2-меркаптоэтанолом или цистеином (см. табл. № 95). В случае первичного сыпного тифа наблюдается снижение титра антител в обработанной сыворотке не менее, чем в 4 раза по сравнению с необработанной исходной сывороткой. При повторном сыпном тифе титр антител в обеих сыворотках должен быть одинаковым (допускается снижение титра не более чем в 2 раза).

Лечение:

Антибиотики. Чаще тетрациклины, левомицетин, рифампицин.

В последние годы летальность совсем не регистрировалась.

Профилактика:

· Ранняя диагностика, изоляция и госпитализация больных.

· Санитарная обработка в очаге (дезинсекция).

· Учет и наблюдение за контактировавшими с больными.

· Осмотры на педикулез, санпросвет работа среди населения.

· Вакцинация сухой живой сыпнотифозной вакциной, изготовленной из авирулентного штамма Е. В связи со значительным улучшением санитарного состояния населения иммунизации подлежат только отдельные контингенты.

Благодаря значительному улучшению условий жизни людей и проведению профилактических мероприятий эпидемический сыпной тиф на большей части территории Беларуси ликвидирован. Сухая живая комбинированная сыпнотифозная вакцина Е(ЖКСВ – Е) – смесь живой яичной культуры риккетсий Провачека вакцинного штамм Е, выращенной в курином эмбрионе, с растворимым антигеном вирулентного штамма риккетсий Провачека. Применяется для активной иммунизации против сыпного тифа. Есть химическая сыпнотифозная вакцина.

Риккетсии Музера.

Возбудитель открыт в 1928 г. Х. Музером. По своим биологическим свойствам во многом сходен с риккетсиями Провачека.

Морфология.

Менее полиморфны, чем R.prowazekii. Это - мелкие палочки и кокковидные клетки длиной 0,7-1,3 мкм и шириной 0,35-0,6 мкм, редко образуют нитевидные клетки. Грам -, по Здрадовскому окрашиваются в красный цвет.

Культуральные свойства.

Хорошо размножаются в курином эмбрионе и некоторых культурах клеток, образуя, как и риккетсии Провачека бляшки, t° _optim 35°C.

Токсикообразование: эндотоксин.

Антигены:

1) Термостабильный Аг, общий с риккетсиями Провачека;

2) Термолабильный Аг, видоспецифический, он позволяет дифференцировать от других видов риккетсий.

Этиопатогенез.

Эндемический, или крысиный, сыпной тиф – остролихорадочная зоонозная инфекция, встречающаяся среди крыс, серых и черных мышей, которые и являются источником инфекции. Передается их паразитами: крысиными блохами, способными нападать на человека, крысиными вшами, не нападающими на людей, и гамазовыми клещами. Эктопаразиты заражаются при кровососании, риккетсии размножаются у них в кишечнике и выделяются с фекалиями. Циркуляция риккетсий происходит по цепи крыса или мышь → крысиная блоха или вошь → крыса или мышь.

Человек заражается:

Ø путем втирания в кожу при расчесах фекалий блох;

Ø аэрогенно при попадании фекалий на слизистые оболочки верхних

дыхательных путей;

Ø алиментарным путем при загрязнении пищевых продуктов мочой грызунов.

Эндемический сыпной тиф распространяется повсеместно, особенно в зонах большого количества крыс (морские порты), а так же в тех местах, где имеются случаи эпидемического сыпного тифа. Патогенез сходен с эпидемическим сыпным тифом.

Постинфекционный иммунитет стойкий и продолжительный (пожизненный), при этом создается невосприимчивость и к эпидемическому сыпному тифу.

Лабораторная диагностика:

1) Серодиагностика – РАР и РСК со специфическими антигенами, позволяет ставить диагноз крысиного сыпного тифа и дифференцировать его от эпидемического сыпного тифа;

2) Биопроба – заражение самцов морских свинок (у них развивается лихорадка и периорхит при эндемическом, и только лихорадка при эпидемическом сыпном тифе).

Специфическая терапия – антибиотики тетрациклинового ряда, средств специфической профилактики нет.

Коксиеллы Бернета.

Coxiella burnetii – относится к роду Coxiella, семейству Rickettsiaceae. Являются возбудителем Ку-лихорадки (от англ. query – неясный, неопределенный). Болезнь впервые была описана в 19 веке в Австралии, а затем в других странах. Возбудителя впервые идентифицировали как риккетсии Ф. Бернет и М. Фриман.

Морфология:

Грам -, неподвижные, мелкие кокковидные или палочковидные образования размером 0,25 х 1,5 мкм. По Романовскому-Гимзе → в иссиня-пурпурный цвет, по Здрадовскому → в красный.

Культивирование:

Облигатные внутриклеточные паразиты с автономным, в отличие от вирусов обменом веществ. Культивируются в желточных мешках куриного эмбриона или в культуре клеток (куриных и мышиных фибробластов), размножаясь почти исключительно в вакуолях.

Резистентность:

Довольно устойчивы к воздействию физических и химических факторов. До 90°C выдерживают больше часа. Длительно сохраняются в окружающей среде.

Антигены:

Два Аг – Ι фазы и ΙΙ фазы. Аг Ι фазы является поверхностным полисахаридным, Аг ΙΙ фазы глубоко в клетке, его химическая природа неизвестна. Способность к образованию токсина у риккетсий Бернета пока не доказана.

Этиопатогенез:

Ку-лихорадка встречается повсеместно, не зарегистрирована только в Финляндии, Швеции, Норвегии, Дании, некоторых странах Западной Африки и Южной Америки). Ку-лихорадка – зоонозная инфекционная болезнь, характеризующаяся полиморфной клинической картиной с преимущественным поражением легких. Паразитирование C. burnetii выявлено у многих видов млекопитающих, птиц, членистоногих. Установлено носительство их у 92 видов диких млекопитающих, 72 видов птиц, 73 видов клещей. Особенно опасны домашние животные (лошади, рогатый скот, собаки) и грызуны. В природных очагах передача возбудителя происходит трансмиссивным путем (клещи). В сельскохозяйственных очагах источником возбудителя является крупный и мелкий рогатый скот, лошади и верблюды. Передача возбудителей происходит воздушно-пылевым (при обработке шерсти, кожи зараженных животных) и пищевым (при употреблении молока и молочных продуктов), контактным и трансмиссивным путями.

Заражение здорового человека от больного не наблюдается.! Возбудитель → в кровь (виремия) → поражает многие органы и ткани, чаще легкие. Протекает как лихорадочное заболевание, с развитием аллергии.

Постинфекционный иммунитет – прочный и длительный, повторно редко.

Лабораторная диагностика:

Ø Биопроба.

Ø Микробиологический.

Ø Серодиагностика.

Ø Кожно-аллергический.

Материал: кровь, мокрота, моча.

Морских свинок заражают материалом от больного → из селезенки морских свинок возбудителей выделяют путем культивирования на курином эмбрионе. Для серодиагностики применяют РАР, РСК, разработан ИФА.

Для диагноза может быть использована кожно-аллергическая проба с Аг.

Специфическая терапия: антибиотики тетрациклинового ряда и левомицетин.

Специфическая профилактика: П. Ф. Здродовский и В. А. Гениг разработали эффективную живую вакцину из штамма М-44 для профилактики Ку-лихорадки.