ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ПРОКАРИОТ
Геном прокариот может состоять из одной или нескольких крупных молекул ДНК, называемых хромосомами, и небольших молекул ДНК – плазмид. В хромосомах представлены практически все гены, необходимые для жизнедеятельности бактерии. Плазмиды же несут гены, необязательные для бактерии, без них клетка может обойтись, хотя в некоторых условиях они способствуют ее
выживанию.
Хромосомы и плазмиды могут представлять собой как кольцевые, так и линейные двухцепочечные молекулы ДНК. Геном бактерий может состоять из одной или нескольких хромосом и плазмид. Хромосома(ы) в бактериальной клетке пред-ставлена(ы) в виде одной копии, т.е. бактерии гаплоидны. Плазмиды же могут присутствовать в клетке как в виде одной копии, так и в нескольких.
Хромосома уложена в компактную структуру – нуклеоид, который имеет овальную или сходную с ней форму. Его структура поддерживается ДНК-связывающими гистоноподобными белками и молекулами РНК. С нуклеоидом также ассоциированы молекулы РНК-полимеразы и ДНК-топоизомеразы I. По периферии нуклеоида располагаются петли хромосомной ДНК, которые находятся в транскрипции в активном состоянии. При подавлении транскрипции эти петли втягиваются внутрь. Нуклеоид не является стабильным образованием и во время различных фаз роста бактериальных клеток изменяет свою форму. Изменение его пространстве ой организации сопряжено с изменением транскрипционной активностью определенных генов бактерий.
В состав хромосомы могут входить геномы умеренных фагов. Включение их геномов в клеточный может происходить после заражения фагами бактерий. При этом одни фаговые геномы интегрируют в строго определенные участки хромосомы, другие – в участки различной локализации.
Размер геномов прокариот колеблется от нескольких сотен тысяч до десятка миллионов пар нуклетидов.
Геномы прокариот отличаются друг от друга по содержание ГЦ-пар, их доля в их составе колеблется от 23 до 72 %. Интересно, что в ДНК бактерий, обитающих при высоких температурах, содержание этих нуклеотидов повышено. Их преобладание над АТ-парами обуславливает более высокую температуру плавления ДНК, что является жизненно необходимым фактором для таких бактерий. Нужно
отметить, что в белках термофильных бактерий повышено также и содержание полярных аминокислот, что делает их более устойчивыми к денатурации при повышенных температурах. В составе белков хеликобактерий (обитающих в кислой среде) больше аминокислотных остатков аргинина и лизина. Остатки этих аминокислот способны связывать ионы водорода, тем самым, оказывая влияние на кислотность среды, и способствуя выживанию бактерий в сложных экологических условиях.
О числе генов в геноме судят по наличию в их составе открытых рамок считывания (ОРС). ОРС представляет собой полинуклеотидную последовательность, потенциально способную кодировать полипептид. О существовании ОРС на тех или иных участках ДНК судят на основании расшифрованной первичной структуры ДНК.
Основным критерием принадлежности участка полинуклеотидной цепи к ОРС служит отсутствие стоп-кодонов на достаточно протяженном участке после стартового кодона. В то же время наличие ОРС является недостаточным условием для утверждения о наличии на данном участке ДНК гена.
Гены, прокариот, как правило, имеют оперонную организацию. В одном опероне обычно представлены гены, ответственные за осуществление одного и того же метаболического процесса.
ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ
Хранителем генетической информации у эукариот так же как и у прокариот, является двухцепочечная молекула ДНК. Основная часть генетической информации у них сосредоточена в клеточном ядре в составе хромосом, значительно меньшая часть представлена в составе ДНК митохондрий, хлоропластов и других пластид.
Геномная ДНК эукариот представляет собой совокупность ДНК гаплоидного набора хромосом и внехромосомной ДНК, представленные в клетке зародышевой линии. Общее содержание ДНК, приходящиеся на один гаплоидный набор, носит название величина С. Ее выражают в пг ДНК, дальтонах или в парах нуклеотидов (1 пг = 6,1 • 1011Да = 0,965 • 10 п.н.). Значение величины С, как правило, возрастает с увеличением организации живых ор- ганизмов. Однако, у некоторых родственных видов величины С могут значительно отличаться, в то время как морфоло-гия и физиология этих видов отличаются друг от друга несущественно.
Каково же значение негенной ДНК? Существуют несколько гипотез, объясняющих ее роль. Одной из таковой является предположение, что некодирующие последовательности генома эукариот способствуют защите генов от химических мутагенов.
Ядерная ДНК эукариот состоит из уникальных и повторяющихся последовательностей. Повторяющаяся ДНК в свою очередь может быть разделена на две фракции: умеренно повторяющаяся и часто повторяющаяся ДНК:
К часто повторяющейся принадлежит ДНК, представленная в геноме более 105 копий. К этой фракции относится сателлитная ДНК.
Содержание сателлитной ДНК составляет в геноме эукариот от 5 до 50 % от всей ДНК. Эта ДНК преимуществе о обнаруживается в центромерных и теломерных рай- онах хромосом, где она выполняет структурные функции. Сателитная ДНК состоит из тандемных повторов длиной от 1 до 20 и более п.н. Благодаря простоте организации и многочисленным копиям эта ДНК обладает способностью к быстрой ренатурации.
В геноме эукариот различают микросателлиты, минисателлиты и макросателлиты. Микросателлиты образованы многократно повторяющимися мономерными звеньями (1 – 4 п.н) и имеют размер до нескольких сотен пар нуклеотидов. Они разбросаны по геному, их длина и общее количество копий коррелирует с размером генома. Количество копий микросателлитов в геноме может достигать десятков и сотен тысяч.
Макросателлиты обладают в сравнении с микросателлитами и минисателлитами большим размером повторяющегося звена до 1000 и более пар нуклеотидов. Они обнаружены в геномах птиц, кошек и человека.
Умеренно повторяющиеся последовательности в геноме представлены до 104 копий. К ним относятся генные семейства и МГЭ.Генные семейства образуют гены, обладающие гомологичной (или идентичной) нуклеотидной последовательностью, и выполняющие одну и ту же или сходные функции. Они могут быть организованы в виде кластеров или же разбросаны по геному. Существование генов в большом числе копий обеспечивает повышенное образование продуктов их экспрессии. Семейства образуют гены гистонов, рРНК, тРНК и др. МГЭ эукариот составляют в среднем около 10 – 30 % генома. Они могут концентрироваться в определенных участках хромосомы или быть рассеянными по геному
К уникальной ДНК относятся неповторяющиеся нуклеотидные последовательности. Ее содержание у различных видов варьирует от 15 до 98 %. Доля уникальных последовательностей ДНК у низших эукариот значительно выше, чем у высших. К уникальной ДНК относятся как кодирующие, так и не кодирующие последовательности. При этом большая часть уникальной ДНК не несет функции кодирования. К некодирующей уникальной ДНК относятся интроны, к кодирующей – экзоны.
Строение м-РНК
Информационная (матричная) РНК (иРНК, мРНК; messenger RNA, mRNA): однонитевая РНК, содержащая информацию об аминокислотных последовательностях белка.
мРНК содержится в ядре и цитоплазме. Функция ее состоит в переносе информации о структуре белка от ДНК к месту синтеза белка в рибосомах. На долю м-РНК приходится примерно 0,5-1% от общего содержания РНК клетки.
Зрелая мРНК эукариот наряду с основной последовательностью нуклеотидов, в которой закодирована информация о последовательности аминокислот в соответствующем белке, содержит целый ряд некодирующих последовательностей, необходимых для ее трансляции рибосомами. Часть этих последовательностей, такие как кэп-группа и 3'-концевая поли(А), не кодируются непосредственно генами, а добавляются ко- и посттранскрипционно, другие имеют генное происхождение. Эти последовательности часто содержат регуляторные сигналы, обеспечивающие определенный уровень трансляции мРНК рибосомами.
Участок мРНК, расположенный между кэп-группой и первым инициирующим кодоном основнойоткрытой рамки считывания (ОРС), которая и несет информацию о последовательности аминокислот в белке, получил название 5'-концевой нетранслируемой области (5'UTR - 5' untranslated region), илилидерной последовательности. Сегмент мРНК, расположенный между последним терминирующим кодоном основной ОРС и началом поли(А)- последовательности, называют 3'-концевой нетранслируемой областью (трейлером) - (3'UTR). Первое название не совсем удачно: последовательности 5'UTR, как правило, способны образовывать сложные вторичные структуры типа "стебель-петля" и содержать короткие ОРС (uORF - upstream open reading frame), которые оказывают сильное влияние на эффективность трансляции мРНК.
Помимо этого, 5'UTR могут включать в себя регуляторные последовательности, распознаваемые транс-действующими белковыми факторами. Последовательности 5'UTR обеспечивают регулируемую трансляцию мРНК (и координированную экспрессию соответствующих генов) в онтогенезе многоклеточных организмов.
3'UTR и поли(А)-последовательность оказывают влияние на состояние рибосом после терминации синтеза полипептидных цепей. Кроме того, 3'-концевая поли(А)-последовательность участвует в инициации трансляции.
31)ПРОЦЕССИНГ РНК
Процессингу подвергаются различные виды РНК: иРНК, рРНК, тРНК и др. Наиболее ярко постранскрипционные модификации РНК выражены у эукариот. У прокариот процессинг РНК необходим при образовании зрелых молекул рРНК и тРНК.
ПРОЦЕССИНГ иРНК
В процессе созревания иРНК эукариот происходит образование на 5’-конце кэпа, удаление интронов, синтез на 3’-конце полиА-последовательности. В отличие от эукариот иРНК только в единичных случаях подвержены процессингу. Эукариоты Созревание иРНК происходит в ядре эукариотических клеток. Этот процесс начинается, как правило, уже в ходе транскрипции. К 5’-концу иРНК присоединяется кэп. На 3’-конце иРНК по окончании транскрипции образуется полиА-последовательность, сигналом для полиаденилирования служит последовательность AAUAAA, расположенная за 11 – 30 нуклеотидов до сайта полиаденилирования. иРНК эукариот также подвергаются сплайсингу. Зрелая иРНК транс-портируется из ядра в цитоплазму клетки, где она служит матрицей для синтеза белка Рис.5.18. Процессинг иРНК эукариот
Следует отметить, что некоторые иРНК экариот не имеют полиА-последовательностей, и что некоторые предшественники иРНК не содержат интронов. Естественно, что они неподвергаются сплайсингу. Процессинг иРНК прокариот иРНК прокариот, как правило, процессингу не подвергается, потому что процессы транскрипции итрансляции у них сопряжены. Еще до завершения транскрипции с иРНК, синтезируемой РНКполимеразой, взаимодействуют рибосомы, которые и начинают син-тез полипептидных цепей Некоторые полицистронные иРНК прокариот могут расщеп-ляться с образованием индивидуальных иРНК. В одних случаях такое расщепление необходимо для успешной трансляции, в других не является обязательным. В некоторых случаях 3’-конец иРНК прокариот подвергается посттранскрипционному полиаденилированию, размер поли А-последовательностей составляет 14 – 60 нуклеотидов. Некоторые пре-иРНК прокариот содержат интроны.
ПРОЦЕССИНГ тРНК
Почти все тРНК синтезируются в виде предшественников – более длинных молекул (пре-тРНК). В результате процессинга происходит удаление нуклеотидных последовательностей с флангов пре-тРНК. С 5’-конца фрагмент нуклеотидной цепи отщепляет фермент, называемой РНК-азой. РНКазой являетсярибонуклеопротеином,каталитическую функцию в котором осуществляет РНК-компонент, белок же выполняет структурную роль. В бактериальной РНКазе есть участок, комплементарный ЦЦА участку тРНК. Эукариотическая РНКаза P узнает другие элементы предшественника тРНК. С 3’-конца пре-тРНК действует экзонуклеаза, укорачивающая РНК постепенно, удаляя по одному нуклеотиду. На заключительных ста-диях созревания тРНК к 3’-концу полинуклеотидилтрансфераза присоединяет последовательность ЦЦА (рис. 5.20). Общая схема процессинга тРНК. У прокариот ЦЦA-последовательность может быть закодиро-вана в генах тРНК, тогда в созревании пре-тРНК, считанных с таких генов, полинуклеотидилтрансфераза может не участвовать. Однако в некоторых случаях ЦЦА-последовательность может быть удалена экзонуклеазой в процессе созревания тРНК, тогда для ее восстановления необходимо участие нуклеотидилтрансферазы. У эукариот ЦЦA-последовательность не кодируется в генах тРНК, она добавляется посттранскрипционно. У прокариот первичный транскрипт может содержать несколько последовательностей тРНК, их процессинг включает вырезание
индивидуальных молекул тРНК. В процессе созревания тРНК также происходит модификация азотистых оснований – в результате которой образуются минорные основания: псевдоуридин, дигидроуридин, тимидин, 7-метил-гуанозин, инозин и др. Сплайсинг пре-тРНК В процессе сплайсинга нуклеаза вырезает интрон, а лигаза обеспечивает сшивание двух фрагментов тРНК за счет образования фосфодиэфирной связи, в результате обра-зуется ковалентно замкнутая молекула тРНК (рис. 5.22). ПРОЦЕССИНГ рРНК Поцессинг необходим для созревания как прокариотических рРНК, так и эукариотических.
Прокариоты
Образование рРНК у прокариот происходит в результате процессинга первичного транскрипта (30 S), содержащего в своем соста-ве нуклеотидные последовательности всех трех 16S, 23S и 5S рРНК, а также тРНК. При созревании из первичного транскрипта происходит вычленение индивидуальных рРНК и тРНК
Эукариоты
Большие рРНК млекопитающих 18S, 5,8S и 28S синтезируются в составе единого первичного транскрипта, обозначаемого 45S-РНК. 45S-РНК во время транскрипции метилируется. Метилированию подвергаются главным образом остатки рибозы. Из 45S-РНК вырезаются индивидуальные рРНК, которые затем при участии 5S рРНК формируют рибосомы (рис. 5.24). Рис. 5.24. Процессинг рРНК млекопитающих У некоторых примитивных эукариот в составе первичного транскрипта нуклеотидные последовательности, соответствующие 26S РНК, содержат интрон. В результате процессинга из первичный транскрипта не только вырезаются индивидуальные рРНК, но и уда-ляется интрон посредством аутосплайсинга (рис. 5.25). Существование различных видов РНК в клетках живых су-ществ обуславливает протекание важнейших биологических процес-сов, связанных, прежде всего, с реализацией генетической информа-ции закодированной в ДНК. Для приобретения функциональной ак-тивности РНК в большинстве случаев должна подвергнуться слож-нейшим посттранскрипционным модификациям. Только иРНК прокариот для проявления своих биологических свойств, как правило, не нуждается в процессинге.
