Оценка качества ферментного препарата

Определение амилолитической активности (АС). Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до дек­стринов различной молекулярной массы. АС характеризует способ­ность амилолитических ферментов катализировать гидролиз крахма­ла до декстринов и выражается числом единиц указанных ферментов в 1 г препарата.

За единицу амилолитической активности принято такое количе­ство ферментов, которое в строго определенных условиях (темпера­тура, рН, продолжительность действия) расщепляет на 30% до дек­стринов различной молекулярной массы 1 г растворимого крахмала.

Для приготовления основного раствора ферментного препарата берут 0,1 г исследуемого ферментного препарата, растворяют в колбе на 100 см³, доводят объем до метки дистиллированной водой, ра­створ перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Основ­ной раствор ферментного препарата можно хранить не более суток при температуре от +2 до —4°С.

Рабочий раствор ферментного препарата готовят из основного ра­створа таким образом, чтобы в 5 см³ этого раствора содержалось такое количество фермента, под действием которого гидролизуется 20-70% крахмала. Для этого берут различное количество основного

раствора (в зависимости от активности анализируемого препарата) и разбавляют водой до 50 см³ при анализе препарата активностью от 20 до 700 ед./г и до 200 см³ при активности более 700 ед./г.

Необходимое количество основного раствора, которое следует взять для приготовления рабочего раствора фермента, определяют в соот­ветствии с таблицей 38.

Таблица 38

Для приготовления 1%-ного раствора крахмала (субстрата) берут 1 г крахмала (в пересчете на сухое вещество), помещают в мерную колбу на 100 см³, приливают 25 см³ воды, перемешивают, добавляют еще 25 см³ воды и нагревают в кипящей водяной бане до полного растворения крахмала. Затем содержимое колбы охлаждают, добавля­ют 10 см³ ацетатного буферного раствора с рН 4,7 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Приготовление растворов иода. Для приготовления основного ра­створа 0,5 г иода и 5 г иодида калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в малом количестве воды, содержимое переносят в мерную колбу на 200 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Основ­ной раствор иода хранят в темноте и используют в течение 1 мес.

Для приготовления рабочего раствора иода 2 см³ основного ра­створа помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки 0,1 н раствором соляной кислоты. Перед началом использо­вания этого раствора на фотоэлектроколориметре измеряют оптичес­кую плотность при длине волны 453 нм в кюветах 1 см. Она должна быть 0,22. Если отличается, то к раствору добавляют несколько ка­пель основного раствора иода или кислоты.

Приготовление растворов из культуры гриба. Для приготовления основного раствора (вытяжки) 5 г исследуемой культуры гриба пе­реносят в коническую колбу вместимостью 250 см³, добавляют 90 см³ дистиллированной воды и 10 см³ ацетатного буферного раство­ра с рН 4,7. Смесь термосташруют при помешивании 1 ч при 30°С и фильтруют. Фильтрат используют в качестве основного раствора.

Таблица 39

Рабочий раствор готовят из основного в соответствии с данными, приведенными в таблице 39.

Техника определения. В две пробирки (диаметр 20 и высота 180 мм) наливают по 10 см³ 1%-ного раствора крахмала и ставят в термостат при температуре 30°С. Не вынимая пробирок, в них до­бавляют — в одну 5 см³ дистиллированной воды (контрольная), в другую — 5см³ ферментного раствора (опытная). Содержимое в кол­бах перемешивают, выдерживают в термостате точно 10 мин, отби­рают по 0,5 см³ растворов, переносят их в колбы с предварительно налитыми туда по 50 см³ рабочего раствора иода и перемешивают. При этом контрольный раствор окрашивается в синий цвет, а опыт­ный — в фиолетовый различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизовавшего крахмала.

В полученных растворах определяют оптическую плотность при длине волны 656 нм в кюветах 1 см. Для элиминирования (устране­ния) растворителя используют дистиллированную воду.

Оптическая плотность контрольного раствора D, соответствует количеству исходного крахмала субстрата, а оптическая плотность опытного раствора D₂ соответствует количеству крахмала, оставше­гося после действия фермента. Разность оптической плотности конт­рольного и опытного растворов соответствует количеству прогидро-лизовавшего крахмала субстрата.

Количество прогидролизовавшего крахмала (С, г) определяют по формуле С = 0,1 (Dj—DJ/D., где 0,1—количество крахмала, взятое для испытания в качестве субстрата, г.

Если количество прогидролизовавшего крахмала меньше 0,02 или больше 0,07, то анализ повторяют. Для этого при приготовлении рабочего раствора фермента берут большее или меньшее количество исходного раствора для разбавления.

Амилолитическую активность АС (ед-/г) препаратов бактериаль­ного происхождения вычисляют по формуле АС = (5,885 С + 0,001671) 1000/ п, а амилолитическую активность препаратов грибного про­исхождения — по формуле АС, = (7,264 С — 0,03766) 100/ п, где: 1000 и 100 — коэффициенты пересчета мг в г; п — количество фер­ментного препарата, взятого для анализа, мг.

Качественные показатели пивного сусла и пива