Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ћикробиологическое исследование. ÷ель исследовани€: вы€вление антител к возбудителю, выделение и идентификаци€ возбудител€.




÷ель исследовани€: вы€вление антител к возбудителю, выделение и идентификаци€ возбудител€.

ћатериал дл€ исследовани€

 ровь

—пособы сбора материала


—пособы сбора материала

ќсновные методы исследовани€

1. —ерологический.

2. Ѕиологический.

’од исследовани€


’од исследовани€

 онтрольные вопросы

1. ѕеречислите методы диагностики при подозрении на  у-лихорадку.

2. — какой целью повторно став€т –— ?

¬ирусы

¬ирусные заболевани€ возникли в глубокой древности, однако вирусологи€ как наука начала развиватьс€ в конце XIX века.

¬ 1892 г. русский ученый-ботаник ƒ. ». »вановский, изуча€ мозаичную болезнь листьев табака, установил, что заболевание это вызываетс€ мельчайшими микроорганизмами, которые проход€т через мелкопористые бактериальные фильтры. Ёти микроорганизмы получили название фильтрующихс€ вирусов (от лат. virus - €д). ¬ дальнейшем было показано, что имеютс€ и другие микроорганизмы, проход€щие через бактериальные фильтры, поэтому фильтрующиес€ вирусы стали называть просто вирусами.

¬опрос о происхождении вирусов €вл€етс€ предметом многих исследований и дискуссий. ќдни ученые предполагают, что вирусы €вл€ютс€ потомками неклеточных форм живых паразитических микроорганизмов. ƒругие считают, что вирусы возникли в результате регрессивной эволюции одноклеточных микроорганизмов. “ретьи думают, что вирусы произошли из клеточных элементов, ставших автономными системами.

Ѕольшой вклад в изучение вирусов внесли советские вирусологи: ћ. ј. ћорозов, Ќ. ‘. √амале€, Ћ. ј. «ильбер, ћ. ѕ. „умаков, ј. ј. —мородинцев, ¬. ћ. ∆данов и др.

¬ирусы - это неклеточна€ форма существовани€ живой материи. ќни очень малы. ѕо образному выражению ¬. ћ. ∆данова "величину их по отношению к величине средних бактерий можно сравнить с величиной мыши по отношению к слону". ”видеть вирусы стало возможным только после изобретени€ электронного микроскопа.

¬ насто€щее врем€ дл€ изучени€ вирусов используют много методов: химические, физические, молекул€рно-биологические, иммунобиологические и генетические.

¬се вирусы подраздел€ютс€ на поражающие человека, животных, насекомых, бактерии и растени€.

” вирусов наблюдаетс€ большое разнообразие форм и биологических свойств, однако все они имеют общие черты строени€. «релые частицы вирусов называют вирионами.

¬ отличие от других микроорганизмов, содержащих одновременно ƒЌ  и –Ќ , вирион содержит только одну из нуклеиновых кислот - либо ƒЌ , либо –Ќ .

Ќуклеинова€ кислота вирусов может быть однонитчатой и двунитчатой. ѕочти все вирусы, содержащие –Ќ , имеют в своем геноме однонитчатую –Ќ , а содержащие ƒЌ  - двунитчатую ƒЌ . ¬ соответствии с двум€ типами генетического вещества вирусы подраздел€ют на –Ќ - и ƒЌ -содержащие.   ƒЌ -содержащим относ€тс€ 5 семейств, –Ќ -содержащим - 10 семейств.

 лассификаци€ вирусов *

* («десь приведены данные, касающиес€ только некоторых из патогенных дл€ человека вирусов.)


 лассификаци€ вирусов

—труктура вириона. ¬ центре вириона находитс€ нуклеинова€ кислота, котора€ окружена капсидом (от греч. kanca - €щик).  апсид состоит из белковых субъединиц, называемых капсомерами. «релый вирус по химической структуре €вл€етс€ нуклеокапсидом.  оличество капсомер и способ их укладки (рис. 52) строго посто€нны дл€ каждого вида вируса. Ќапример, вирус полиомиелита содержит 32 капсомера, а аденовирус - 252 капсомера.  апсомеры могут быть уложены в виде многогранника с равномерными симметричными гран€ми - кубоидальна€ форма (например, аденовирус). ”кладка в виде спиралей (сферическа€) характерна дл€ вирусов гриппа. ћожет быть тип симметрии, при котором нуклеинова€ кислота имеет вид пружины, вокруг которой уложены капсомеры, в этом случае вирус имеет палочковидную форму - вирус, вызывающий болезнь листьев табака.


–ис. 52. —хематическое изображение расположени€ капсомеров в капсиде вирусов. а - вирус гриппа; б - аденовирус; в - вирус герпеса; г - вирус полиомиелита

—ложный тип симметрии имеет фаг: головка - кубоидальной, а отросток - палочковидной формы (сперматозоидна€ форма) (см. рис. 21, 22).

“аким образом, в зависимости от способа укладки вирусы подраздел€ют на кубоидальную, сферическую, палочковидную и сперматозоидную формы.

Ќекоторые вирусы, обладающие более сложной структурой, имеют оболочку, котора€ называетс€ пеплос. ќна образуетс€ при выходе вируса из клетки хоз€ина. ¬ирусный капсид при этом обволакиваетс€ внутренней поверхностью цитоплазматической мембраны клетки хоз€ина и образуетс€ один или несколько слоев оболочки суперкапсид. “акую оболочку имеют только некоторые вирусы, например вирусы бешенства, герпеса, энцефалита. Ёта оболочка содержит фосфолипиды, разрушающиес€ под воздействием эфира. “аким образом, воздейству€ эфиром, можно отличить вирус, имеющий пеплос, от вируса с "голым капсидом".

” некоторых вирусов из внешнего липидного сло€ оболочки выступают капсомеры в виде шипов (эти шипы тупые). “акие вирусы называютс€ пепломерами (например, вирус гриппа, см. рис. 52).

Ќуклеинова€ кислота вируса €вл€етс€ носителем наследственных свойств, а капсид и внешн€€ оболочка несут защитные функции, как бы оберега€ нуклеиновую кислоту.  роме того, они способствуют проникновению вируса в клетку.

–азмеры вирусов. »змер€ютс€ вирусы в нанометрах. ¬еличина их колеблетс€ в широком диапазоне от 15-20 до 350-400 нм.

ћетоды измерени€ вирусов: 1) фильтрование через бактериальные фильтры с известной величиной пор; 2) ультрацентрифугирование - крупные вирусы осаждаютс€ быстрее; 3) фотографирование вирусов в электронном микроскопе.

’имический состав вирусов.  оличество и содержание ƒЌ  и –Ќ  вирусов неодинаковы. ” ƒЌ  молекул€рна€ масса колеблетс€ от 1Ј106 до 1,6Ј108, а у –Ќ  - от 2Ј106 до 9,0Ј106.

Ѕелки у вирионов обнаружены в незначительном числе, они состо€т из 16-20 аминокислот.  роме капсидных белков, имеютс€ еще внутренние белки, св€занные с нуклеиновой кислотой. Ѕелки обусловливают антигенные свойства вирусов, а также в силу плотной укладки полипептидных цепей ограждают вирус от действи€ ферментов клетки хоз€ина.

Ћипиды и углеводы обнаружены во внешней оболочке сложных вирионов. »сточником липидов и углеводов €вл€етс€ оболочка клетки хоз€ина. ѕолисахариды, вход€щие в состав некоторых вирусов, обусловливают способность их вызывать агглютинацию эритроцитов.

‘ерменты вирусов. ¬ирусы не имеют собственного метаболизма, поэтому они не нуждаютс€ в ферментах обмена веществ. ќднако у некоторых вирусов вы€влено наличие ферментов, способствующих проникновению их в клетку хоз€ина. Ќапример, у вируса гриппа ј обнаружена нейраминидаза, отщепл€юща€ нейраминовую кислоту, содержащуюс€ в оболочках животных клеток (эритроцитов и др.). ” фагов - лизоцим, разрушающий клеточную оболочку, фосфатаза и др.

¬ы€вление вирусных антигенов. ¬ирусные антигены в инфицированных клетках хоз€ина можно обнаружить с помощью метода иммунофлюоресценции. ѕрепараты, содержащие клетки, инфицированные вирусами, обрабатывают специфическими иммунными люминесцирующими сыворотками. ѕри просмотре в люминесцентном микроскопе в местах скоплени€ вирусных частиц наблюдаетс€ характерное свечение. ¬ид вируса определ€ют по соответствию специфической люминесцирующей сыворотки, вызвавшей свечение.

¬недрение вируса в клетку, взаимодействие его с клеткой хоз€ина и репродукци€ (размножение) слагаютс€ из р€да последовательных стадий.

—тади€ 1. Ќачинаетс€ с процесса адсорбции за счет рецепторов вириона и клетки. ” сложных вирионов рецепторы располагаютс€ на поверхности оболочки в виде шиловидных выростов (вирус гриппа), у простых вирионов - на поверхности капсида.

—тади€ 2. ѕроникновение вируса в клетку хоз€ина протекает по-разному у разных вирусов. Ќапример, некоторые фаги протыкают оболочку своим отростком и впрыскивают нуклеиновую кислоту в клетку хоз€ина (см. главу 8). ƒругие вирусы попадают в клетку путем вт€гивани€ вирусной частицы с помощью вакуоли, т. е. на месте внедрени€ в оболочке клетки образуетс€ углубление, затем кра€ ее смыкаютс€ и вирус оказываетс€ в клетке. “акое вт€гивание называетс€ виропексис.

—тади€ 3. "–аздевание вируса" (дезинтеграци€). ƒл€ своего воспроизведени€ вирусна€ нуклеинова€ кислота освобождаетс€ от защищающих ее белковых покровов (оболочки и капсида). ѕроцесс раздевани€ может начатьс€ во врем€ адсорбции, а может произойти тогда, когда вирус находитс€ уже внутри клетки.

—тади€ 4. Ќа этой стадии происходит репликаци€ (воспроизведение) нуклеиновых кислот и синтез вирусных белков. Ёта стади€ происходит при участии ƒЌ  или –Ќ  клетки хоз€ина.

—тади€ 5. —борка вириона. Ётот процесс обеспечиваетс€ самосборкой белковых частиц вокруг вирусной нуклеиновой кислоты. —интез белка может начатьс€ непосредственно после синтеза вирусной нуклеиновой кислоты либо после интервала в несколько минут или несколько часов. ” одних вирусов самосборка происходит в цитоплазме. ” других в €дре клетки хоз€ина. ќбразование внешней оболочки (пеплоса) всегда происходит в цитоплазме.

—тади€ 6. ¬ыход вириона из клетки хоз€ина происходит путем просачивани€ вируса через оболочку клетки либо через отверстие, образовавшеес€ в клетке хоз€ина (в этом случае клетка хоз€ина погибает).

“ипы взаимодействи€ вируса и клетки. ѕервый тип - продуктивна€ инфекци€ - характеризуетс€ образованием новых вирионов в клетке хоз€ина.

¬торой тип - абортивна€ инфекци€ заключаетс€ в том, что обрываетс€ репликаци€ нуклеиновой кислоты.

“ретий тип - характеризуетс€ встраиванием вирусной нуклеиновой кислоты в ƒЌ  клетки хоз€ина; возникает форма сосуществовани€ вируса и клетки хоз€ина (вирогени€). ¬ этом случае обеспечиваетс€ синхронность репликации вирусной и клеточной ƒЌ . ” фагов это называетс€ лизогени€.

ћикроскопическое исследование. ѕри отдельных вирусных инфекци€х в цитоплазме или €драх клеток организма хоз€ина наблюдаютс€ специфические внутриклеточные тельца - включени€, имеющие диагностическое значение (тельца Ѕабеша - Ќегри при бешенстве, тельца √варниери при оспе и др.). –азмеры вирусных частиц и телец-включений удаетс€ искусственно увеличить специальными методами обработки препаратов с протравой и импрегнацией (например, метод серебрени€ по ћорозову) и наблюдать при иммерсионной микроскопии. Ѕолее мелкие вирионы, лежащие за пределами видимости оптического микроскопа, обнаруживаютс€ только при электронной микроскопии. —уществуют разные точки зрени€ в отношении внутриклеточных включений. ќдни авторы считают, что они представл€ют собой скопление вирусов. ƒругие считают, что они возникают в результате реакции клетки на внедрение вирусов.

√енетика вирусов. ћодификаци€ (ненаследуемые изменени€) у вирусов обусловливаетс€ особенност€ми клетки хоз€ина, в которой происходит репродукци€ вируса. ћодифицированные вирусы приобретают способность заражать клетки, аналогичные тем, в которых они модифицировались. ” разных вирусов модификаци€ по-разному про€вл€етс€. Ќапример, у фагов измен€етс€ форма "негативных п€тен" (фаговых колоний).

ћутаци€ - у вирусов возникает под вли€нием тех же мутагенов, которые вызывают мутацию у бактерий (физические и химические факторы). ¬озникает мутаци€ во врем€ репликации нуклеиновых кислот. ћутации затрагивают различные свойства вирусов, например чувствительность к температуре и др.

√енетическа€ рекомбинаци€ у вирусов может возникнуть в результате одновременного заражени€ клетки хоз€ина двум€ вирусами, при этом может произойти обмен отдельными генами между двум€ вирусами и образуютс€ рекомбинанты, содержащие гены двух родителей.

√енетическа€ реактиваци€ генов иногда происходит при скрещивании инактивированного вируса с полноценным, что приводит к спасению инактивированного вируса.

—понтанна€ и направленна€ генетика вирусов имеет большое значение в развитии инфекционного процесса.

”стойчивость к факторам окружающей среды. Ѕольшинство вирусов инактивируетс€ при действии высоких температур. ќднако имеютс€ исключени€, например вирус гепатита термоустойчив.

  низким температурам вирусы не чувствительны, ультрафиолетовые солнечные лучи оказывают инактивирующее действие на вирусы. –ассе€нный солнечный свет действует на них менее активно. ¬ирусы устойчивы к глицерину, что дает возможность длительно сохран€ть их в глицерине. ќни устойчивы к антибиотикам (при культивировании вирусов исследуемый материал обрабатывают антибиотиками дл€ подавлени€ бактериальной флоры).

 ислоты, щелочи, дезинфицирующие вещества инактивируют вирусы. ќднако некоторые вирусы, инактивированные формалином, сохран€ют иммуногенные свойства, что позвол€ет использовать формалин дл€ получени€ вакцин (вакцина против бешенства).

¬осприимчивость животных.  руг восприимчивых животных дл€ некоторых вирусов очень широк, например к вирусам бешенства чувствительны многие животные. Ќекоторые вирусы поражают только один вид животного, например вирус чумы собак поражает только собак. »меютс€ вирусы, к которым животные не чувствительны - например, вирус кори и т. д.

ќрганотропность вирусов. ¬ирусы обладают способностью поражать определенные органы, ткани и системы. Ќапример, вирус бешенства поражает нервную систему. ¬ирус оспы обладает дермотропностью и т. д.

¬ыделение вирусов в окружающую среду. »з больного организма вирусы могут выдел€тьс€ с калом, например вирус полиомиелита и другие энтеровирусы. ¬ирус бешенства выдел€етс€ со слюной, вирус гриппа - с отдел€емым слизистой носоглотки и т. д.

ќсновные пути передачи вирусов. ¬оздушно-капельный (грипп, оспа), пищевой (полиомиелит, гепатит ј), контактно-бытовой (бешенство), трансмиссивный (энцефалит).

ѕротивовирусный иммунитет. ќрганизм человека обладает врожденной устойчивостью к некоторым вирусам. Ќапример, человек не чувствителен к вирусу чумы собак. ∆ивотные не чувствительны к вирусу кори. ¬ этих случа€х противовирусный иммунитет основан на отсутствии клеток, способных поддерживать репродукцию вирусов.

ѕротивовирусный иммунитет обусловливаетс€ как клеточными, так и гуморальными факторами защиты, неспецифическими и специфическими. Ќеспецифические факторы. ћощным ингибитором репродукции вирусов €вл€етс€ белковое вещество - интерферон. ¬ здоровом организме он содержитс€ в незначительном количестве, а вирусы способствуют продукции интерферона и количество его значительно увеличиваетс€. ќн неспецифичен, так как блокирует репродукцию разных вирусов. ќднако он обладает тканевой специфичностью, т. е. клетки разных тканей образуют неодинаковый интерферон. —читают, что механизм действи€ его заключаетс€ в том, что он преп€тствует синтезу белка в клетке хоз€ина и этим прекращает репродукцию вируса.

  специфическим факторам противовирусного иммунитета относ€тс€ вируснейтрализующие антитела, гемагглютинирующие и преципитирующие.

ћетоды культивировани€ вирусов. ¬ирусы размножаютс€ только в жизнеспособных клетках. »х культивируют: в куриных эмбрионах (рис. 53), культурах ткани человека и различных животных, в организме чувствительных животных, восприимчивых членистоногих.


–ис. 53,  уриный эмбрион. 1 - хорион-аллантоис: 2 - аллантоисна€ полость; 3 - амниотическа€ полость; 4 - желточный мешок; 5 - воздушный мешок; 6 - подскорлупна€ оболочка

¬ первый период развити€ вирусологии основным методом изучени€ вирусов €вл€лось искусственное заражение животных, но этот метод сложный, и кроме этого животные ко многим вирусам оказались невосприимчивы.

Ѕольшое значение в развитии вирусологии имело введение методов культивировани€ вирусов в куриных эмбрионах и в культуре клеток тканей человека и животных.

«аражение куриных эмбрионов. ƒл€ репродукции вирусов используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста, инкубированные в термостате при 37∞ —. Ќеобходимым условием дл€ правильного развити€ зародыша €вл€етс€ соблюдение определенной влажности воздуха, которую можно создать, поместив в термостат сосуд с водой.

ѕригодность куриного эмбриона дл€ заражени€ определ€етс€ по наличию движений эмбриона и развитой сети кровеносных сосудов на хорион-аллантоисной оболочке при просвечивании с помощью овоскопа.

 ультивирование вирусов в куриных эмбрионах проводитс€ в разных местах эмбриона, который заражают (см. рис. 53):

1) на хорион-аллантоисную оболочку,

2) в аллантоисную полость;

3) в амниотическую полость;

4) в желточный мешок.

«аражение куриных эмбрионов провод€т в боксе с использованием стерильных инструментов. ѕеред заражением куриные эмбрионы двукратно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом.

«аражение на хорион-аллантоисную оболочку. ѕосле дезинфекции €йца осторожно срезают кусочек скорлупы с тупого конца, снимают подскорлупную оболочку - при этом обнаруживаетс€ хорион-аллантоисна€ оболочка. »нфекционный материал в количестве 0,1-0,2 мл при помощи шприца или пастеровской пипетки нанос€т на хорион-аллантоисную оболочку. ѕосле заражени€ отверстие закрывают колпачком и просвет между ним и куриным эмбрионом заливают парафином.

Ќа другой стороне €йца простым карандашом пишут название инфекционного материала и дату заражени€.

«аражение в амниотическую полость. яйцо овоскопируют и на боковой стороне выбирают участок, где хорион-аллантоис лишен крупных кровеносных сосудов. Ётот участок отмечают карандашом. яйца укладывают на подставку в горизонтальном положении, дезинфицируют и специальным стерильным копьем прокалывают отверстие в скорлупе на глубину 213 мм, через которое ввод€т на это же рассто€ние иглу с инфекционным материалом непосредственно в амниотическую полость. ƒл€ того чтобы вводима€ жидкость не вытекала обратно, предварительно делают прокол над воздушным мешком, после чего оба отверсти€ заливают парафином.

«аражение в аллантоисную полость. «аражение провод€т в затемненном боксе. ќтмечают воздушное пространство, скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют и через отверстие в скорлупе ввод€т по направлению к эмбриону иглу шприца с материалом. ≈сли игла попала в аллантоисную полость, то наблюдаетс€ смещение тени эмбриона. ѕосле заражени€ отверстие заливают парафином.

«аражение в желточный мешок. —корлупу дезинфицируют. яйцо помещают на подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный мешок был обращен вверх. Ќад воздушной камерой в центре прокалывают отверстие. „ерез отверстие в скорлупе в горизонтальном направлении на глубину 2-3 мм ввод€т иглу шприца, котора€ попадает в желточный мешок. ћатериал ввод€т в объеме 0,2-0,3 мл. ѕосле введени€ материала отверстие парафинируют.

“емпературный режим и длительность инкубации завис€т от биологических свойств введенного вируса.

»нфицированные €йца ежедневно провер€ют - овоскопируют дл€ проверки жизнеспособности эмбриона. ≈сли эмбрионы погибают в первые сутки, то причиной этого обычно бывает травма при заражении. “акие €йца вывод€т из опыта.

ѕри необходимости раздельно исследовать каждую составную часть эмбриона материал собирают в определенном пор€дке: отсасывают аллантоисную жидкость, затем амниотическую жидкость, разрезают хорион-аллантоисную оболочку, отдел€ют амниотическую оболочку, эмбрион, желточный мешок и только после этого извлекают хорион-аллантоисную оболочку, отделив ее от внутренней поверхности скорлупы. Ќаличие вируса в зараженном эмбрионе определ€ют по характерным изменени€м хорион-аллантоисной оболочки зараженного куриного эмбриона.

¬ирусы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, вы€вл€ют с помощью –— .

ƒл€ вы€влени€ вируса в аллантоисной или амниотических жидкост€х зараженных эмбрионов став€т –√ј (гемагглютинаци€ вызываетс€ аллантоисной или амниотическими жидкост€ми или взвесью, приготовленной из хорион-аллантоисной оболочки).

 ультивирование вирусов в культуре клеток. ƒл€ накоплени€ вирусов в чувстсительных клеточных культурах используютс€ ткани человека и различных животных. Ќаибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.

ќднослойные культуры клеток выращивают в стекл€нных плоских сосудах-матрацах.  леточна€ суспензи€ в жидкой питательной среде при температуре 37∞ — позвол€ет получить "in vitro" слой клеток с определенной гистологической структурой. ѕрисутствие вирусов в культурах тканей обнаруживают по изменению (дегенерации) клеток. “ип вирусов определ€ют путем нейтрализации действи€ вирусов при добавлении к вируссодержащему материалу соответствующих типоспецифических сывороток.

Ёти методы позвол€ют быстрее учитывать результаты исследовани€ и €вл€ютс€ более экономичными. ¬ тех случа€х, когда вирусы не вызывают цитопатического действи€ (дегенерации) и не развиваютс€ в куриных эмбрионах, пользуютс€ методами заражени€ животных (см. главу 11).

ƒл€ культивировани€ вирусов используют перевиваемые клетки, которые чаще получают из клеток злокачественных опухолей.

ќднослойные культуры получают из эмбрионов человека, курицы, животных.

ѕреимущество однослойных культур клеток - простота методики и легкость учета.

—пособность клеток к размножению вне организма св€зана со степенью дифференциации ткани. ћенее дифференцированные ткани обладают большей способностью к пролиферации (соединительна€, эпителиальна€ ткань).

—ущность методов при приготовлении первичных культур ткани заключаетс€ в разрушении межклеточной ткани и разобщении клеток дл€ последующего получени€ моносло€.

–азобщение клеток проводитс€ путем воздействи€ на ткань протеолитических ферментов, чаще всего трипсина. –аствор трипсина способствует разъединению клеток при сохранении у них способности к размножению. ƒл€ выращивани€ культуры клеток необходима питательна€ среда. —остав среды сложный, он включает целый р€д ингредиентов: аминокислоты, глюкозу, витамины, минеральные соли, коферменты и т. д. ѕолучение культуры ткани провод€т в строго асептических услови€х. ¬ среду добавл€ютс€ антибиотики (500 ≈ƒ пенициллина и 250 ≈ƒ стрептомицина в 1 мл) дл€ подавлени€ роста бактериальной флоры.

ѕодготовленную ткань заливают 0,25% раствором подогретого трипсина и инкубируют в термостате при 37∞ —. ¬о врем€ инкубации ткань периодически помешивают путем вращени€ колбы. “рипсинизированные клетки центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 5 мин.

“рипсинизацию и центрифугирование провод€т очень осторожно, чтобы не травмировать клетки. ѕосле центрифугировани€ надосадочную жидкость удал€ют, а осадок клеток помещают в небольшой объем питательной среды. ƒл€ получени€ однородной массы взвесь клеток фильтруют через один слой марли в воронке (стерильной). ¬звесь клеток провер€ют на стерильность путем посева по 0,1 мл, в 2 пробирки с сахарным бульоном.

”спех культивировани€ клеток зависит от посевной ƒозы, поэтому после трипсинизации производ€т подсчет клеток в камере √ор€ева. ѕосле подсчета взвесь клеток развод€т питательной средой из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалось 500000-1000000 клеток и разливают по пробиркам и матрацам. ѕробирки с культурой ткани инкубируют в термостате в наклонном положении.

ѕосе€нные культуры ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа дл€ определени€ характера их роста. Ќормальные пролиферирующие клетки светлые и растут однослойным пластом. ≈сли клетки темные, зернистые и не пролиферируют, что может быть результатом загр€знени€ (плоха€ обработка посуды или загр€знение ингредиентов), то такие культуры изымают из опыта.

—мена питательной среды через 2-3 дн€ после посева улучшает интенсивность пролиферации.

Ќормальные, хорошо пролиферирующие клетки заражают исследуемым материалом.

ѕеревиваемые культуры преимущественно получают из злокачественных опухолей. Ўтамм Hela - культура клеток рака шейки матки женщины по имени Helena (получен в 1950 г.); штамм Ќер-2 выделен от больного раком гортани. –ост этих клеток поддерживаетс€ в лаборатори€х путем последовательных пассажей. ќсобенность их заключаетс€ в том, что они размножаютс€ в течение длительного срока. ¬ насто€щее врем€ эти клетки прошли уже тыс€чи генераций. ¬ процессе пассажей они тер€ют некоторые морфологические и биохимические свойства - подвергаютс€ мутации. ќднако остаютс€ вполне пригодными дл€ культивировани€ в них вирусов.  ультурой этих клеток пользуютс€ лаборатории всего мира.

–азмножение вируса в культуре клеток происходит в различные сроки в зависимости от свойств вируса и вида клеток.

ќ наличии вируса суд€т по цитопатическому действию. ¬ микроскопе наблюдаетс€ дегенераци€ клеток. ¬рем€ цитопатического действи€ и его характер завис€т от дозы и свойств вируса.

” некоторых вирусов цитопатическое действие обнаруживаетс€ через несколько дней (вирус оспы), у других - через 1-2 нед (вирус гепатита и др.).

¬ насто€щее врем€ известны уже сотни вирусов, поражающих человека. Ѕорьба с вирусными инфекци€ми осуществл€етс€ разными методами. Ќаиболее эффективна иммунизаци€. “аким способом ликвидирована оспа, сокращена заболеваемость полиомиелитом. ¬ажное значение в борьбе с вирусными инфекци€ми имеют общественна€ профилактика - уничтожение брод€чих собак (борьба с бешенством), лична€ профилактика и т. д.

ќднако эти меры не могут обеспечить ликвидацию всех вирусных заболеваний. ”ченые настойчиво ищут пути, при помощи которых можно было бы поразить вирус, не повредив клетку, в которой он находитс€.

ѕоэтому закономерно, что в программе  ѕ—— вирусологи€ названа одной из ведущих отраслей естественнонаучных знаний, котора€ должна получить преимущественное развитие в ближайшие годы.

ќсновные методы исследовани€ вирусов. 1. –еакци€ гемагглютинации, реакци€ задержки гемагглютинации, реакци€ непр€мой гемагглютинации. –еакци€ св€зывани€ комплемента.

2. –еакци€ нейтрализации вирусов в культуре тканей.

3. ћетод иммунофлюоресценции.

4. √истологический метод - вы€вление включений (телец Ѕабеша - Ќегри - при бешенстве; телец ѕашена - при оспе и др.).

5. Ѕиологический метод.

–Ќ -содержащие вирусы





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2016-11-22; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 759 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

≈сть только один способ избежать критики: ничего не делайте, ничего не говорите и будьте никем. © јристотель
==> читать все изречени€...

1214 - | 1184 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.051 с.