Визначення кислотного числа.

Хід роботи. У пробірку вносять 2 мл розчину яєчного білка і нагрівають на киплячій водяній бані. Спостерігають утворення осаду (згортання білка).

Щоб порівняти залежність осадження білків від концентрації водневих іонів, у п'ять пробірок вносять по 2 мл розчину яєчного білка.

Нейтральний розчин білка в першій пробірці нагрівають до кипіння, спостерігається опалесценція (помутніння), обумовлена руйнуванням гідратної оболонки навколо молекули білка і збільшення білкових часток. Але міцели білка несуть заряд і тому залишаються в розчині, не випадаючи в осад.

Розчин у другій пробірці нагрівають до кипіння, вливають 1 мл 1%-го розчину оцтової кислоти до слабокислої реакції. При стоянні білок випадає в осад. У цих умовах частки білка втрачають заряд, тому що рН середовища близька до ізоелектричного стану.

У третю пробірку вносять 1 мл 10%-го розчину оцтової кислоти для створення кислої реакції середовища. При кип'ятінні розчину осад не утворюється, тому що молекули білка здобувають позитивний заряд, що підвищує їх стійкість.

У четверту пробірку додають 1 мл розчину оцтової кислоти, кілька краплин насиченого розчину хлориду натрію і нагрівають. Випадає білий осад. Його утворення обумовлене тим, що білок при взаємодії з іонами хлориду натрія втрачає свій заряд.

У п'яту пробірку вносять 1 мл 10%-го розчину гідроксиду натрію для створення лужного середовища. При кип'ятінні рідину осад не утворюється, тому що в лужному середовищі збільшується негативний заряд білка.

Результати щодо випадіння осаду заносять до таблиці, форма якої наведена нижче:

3.4. Визначення відновленого глутатіону.

Глутатіон один із найбільш поширених природних пептидів, який знайдено майже у всіх клітинах рослин, тварин, а також у бактеріях і дріжджах. Він складається з трьох амінокислот – глутамінової кислоти, цистеїну і гліцину. Глутатіон виконує роль коферменту в деяких реакціях внутрішньо молекулярного перенесення водню та ізомеризації; функціонально активною групою є сульфгідрильна група цистеїну. Відновлена форма глутатіону (Гл – SH) легко окислюється, наприклад молекулярним киснем у присутності металів або йодом, утворюючи окислену форму (Гл–S–S–Гл).

Окислення може відбуватися також ферментативно за участю глутатіондегідрогенази, а також, дегідроаскорбінової кислоти.

Глутатіон бере участь у багатьох фізіологічних процесах в організмі, йому належить велика роль а оборотних перетвореннях дисульфідних груп білків в сульфгідрильні. Зокрема, відновлена форма глутатіону підвищує активність тіолових ферментів, які містять в активному центрі сульфгідрильну групу. До тіолових ферментів належить протеолітичний фермент рослинного походження папаїн. Папаїн міститься у борошні, і підвищення його активності призводить до розпаду білків борошна і дріжджів, що знижує якість харчових продуктів. Для запобігання руйнування клейковини під впливом папаїну відновлений глутатіон окислюють, наприклад, (KBrO₃) або дегідроаскорбіновою кислотою.

Мета роботи: засвоєння методу визначення відновленого глутатіону.

Завдання на виконання роботи: провести кількісне визначення відновленого глутатіону у борошні чи дріжджах.

Апаратура: лабораторна центрифуга, шутель-апарат, годинник.

Лабораторний посуд: мірні колби на 100 мл; мірні циліндри на 100 мл; піпетки на 5 мл; конічні колби на 100 мл; скляні палички.

Матеріали та реактиви: 1. 1 М розчин сульфосаліцилової кислоти; 2. 4%–й розчин сульфосаліцилової кислоти; 3. 0,005 н. розчин КJOз; 4. 0,001 н. розчин KJO₃; 5. 5%–й розчин KJ; 6. 1%–й розчин крохмалю; 7. 5%-й розчин сульфату кадмію.

Принцип методу оснований на окисленні відновленого глутатіону йодом у кислому середовищі;

Хід роботи. У мірну колбу на 100 мл вносять 10 г дослідного матеріалу (борошно або дріжджі). Поступово, перемішуючи, доливають 80 мл дистильованої води. Колбу з сумішшю поміщають на шутель–апарат і перемішують протягом 10 хв. Потім, повільно перемішуючи, додають 5 мл 1 М розчину сульфосаліцилової кислоти, залишають на 30 хв., після цього доводять водою до мітки і знову інтенсивно перемішують. Суміш переносять у центрифужні пробірки і центрифугують. У центрифугаті визначають загальну кількість SH–груп, перераховуючи на відновлений глутатіон.

У конічну колбу на 100–150 мл піпеткою вносять 25 мл центрифугату (що відповідає 2,5 г наважки), додають 25 мл дистильованої води і, перемішуючи,вносять по 2,5 мл 4%–го розчину сульфосаліцилової кислоти і 5%–го розчину KІ. Додають 10 краплин 1%–го розчину крохмалю і титрують 0,001 н. розчином KІO₃ до появи синього забарвлення. Для контролю чистоти реактивів в аналогічних умовах титрують 50 мл дистильованої води.

Розрахунок кількості сульфгідрильних сполук у перерахунку на відновлений глутатіон проводять за формулою;

,

де А – кількість сульфгідрильних сполук, мг%; a і b – об’єми 0,001 н. розчину KJO₃, які пішли на титрування, відповідно до проби і контролю, мл; 12,28 – коефіцієнт перерахунку на відновлений глутатіон.

Для визначення кількості відновленого глутатіону піпеткою Мора відбирають 50 мл центрифугату (5 г не важки) в мірну колбу на 100 мл. Додають 40 мл 5%-го розчину сульфату кадмію і 4 мл 1 н. розчину гідроксиду натрію. Суміш ретельно перемішують, доводять дистильованою водою до мітки і залишають стояти протягом 30 хв. Потім суміш центрифугують,

У конічну колбу на 100–150 мл вносять 50 мл центрифугату (2,5 г наважки) і визначають кількість SH –сполук, що залишилися в розчині, за допомогою описаної вище методики;

,

де B – кількість SH–сполук, мг%; a₁, і b₁ – об'єми 0,001 н. розчину KJO₃, які пішли на титрування, відповідно до проби і контролю, мл.

Кількість відновленого глутатіону в наважці визначають за різницею між загальною кількістю сульфгідрильних сполук і кількістю, що залишилась після осадження відновленого глутатіону сульфатом кадмію:

4. Якісне та кількісне визначення вітамінів.

4.1. Кількісне визначення каротинів.

До чисельних природних кольорових речовин, які надають жовтого, оранжевого та червоного забарвлення рослинним продуктам, відносяться пігменти – каротини. Всі ці речовини мають біологічну активність вітаміну А.

		β-каротин

Біологічна активність цих сполук обумовлена тим, що вони у тварин під дією ферментів розкладаються з утворенням вітаміну А. До найважливіших провітамінів А належать природні каротиноїдні вуглеводні: α- β-, й- γ- каротини. А-вітамінна активність обумовлена наявністю в їх структурі кільця β–іонону, зв'язаного з аліфатичним ланцюгом, який складається з системи спряжених подвійних зв'язків ізопреноїдного характеру.

Апаратура: фотоелектроколориметр, вакуумний насос.

Лабораторний посуд: порцелянові ступки, адсорбційна колонка, мірні циліндри, мірні колби, скляні палички, пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. бензин; 2. сульфат натрію безводний; 3. вуглекислий магній; 4. оксалат натрію; 5. біхромат калію; 6. тальк; 7. дистильована вода.

Принцип методу полягає в екстрагуванні каротину бензином з рослинної сировини, попередньо ретельно розтертої з безводним сульфатом натрію. Отриманий розчин доводять до визначеного об'єму бензином і колориметрують.

Хід роботи. 0,5 г подрібненої моркви, червоного перцю або зеленого листя розтирають у ступці з 2 г безводного сульфату натрію та 0,5 г вуглекислого магній. Після розтирання суміш протягом 5–10 хв. підсушують. Порошок переносять у адсорбційну колонку. Для цього використовують скляний фільтр № 3 діаметром 25 мм, в який насипають 10 г добре розтертої суміші оксалату натрію і тальку (1:1) та ущільнюють її. Підсушену наважку висипають у колонку, ущільнюють її паличкою та закривають зверху ватним тампоном. Ступку обполіскують 5 мл бензину, який теж виливають у колонку. Після цього вмикають насос і відсмоктують із швидкістю 50–60 крапель за 1 хв. Колонку промивають порціями бензину по 3 мл до повного вимивання нижньої оранжевої смуги каротину, яка знаходяться попереду. За нею йде жовта смуга ксантофілів, а вище – синя смуга хлорофілу. Розчин каротину переносять до мірного циліндра й доводять бензином до потрібного об'єму (10 чи 15 мл). Інтенсивність забарвлення отриманого розчину каротину визначають на ФЕК при 450 або 440 нм (синій світлофільтр).

Далі по калібрувальній кривій за отриманими значеннями оптичної густини знаходять відповідні їм значення концентрації каротину у сировині за формулою:

де Х – вміст каротину, мг/100 г речовини; 0,1 – коефіцієнт перерахунку мікрограмів у міліграми на 100 г речовини; А – об'єм досліджуваного розчину каротину, мл; Н – наважка досліджуваної речовини, г; С – концентрація стандартного розчину каротину (по кривій), мкг/мл.

Побудова калібрувальної кривої. Для побудови калібрувальної кривої можна використати стандартні розчини кристалічного каротину або хімічно чистих азобензолу чи біхромату калію.

0,36 г біхромату калію розчиняють у 100 мл дистильованої води (основний розчин): 1 мл цього розчину відповідає 20,8 мг каротину. З основного розчину готують шкалу стандартних розчинів (табл. 4.1). Загальний об'єм кожного стандарту складає 50 мл. Готові стандартні розчини колориметрують на ФЕК.

Для побудови калібрувальної кривої на міліметровому папері проводять координатні осі. На осі абсцис відкладають концентрації стандартних розчинів біхромату калію (мкг у 1 мл), на осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини, отримані на ФЕК. Із знайдених точок проводять перпендикуляри до Їх перетин: Отримані точки перетину з’єднують між собою. Ця лінія і буде калібрувальною кривою.

Таблиця 4.1

4.2. Якісне визначення вітаміну Д₂ (ергокальциферолу).

Кальцифероли – вітаміни групи Д – складаються з двох підгруп:

1) природних: Д₂ – ергокальциферол,

Д₃ – холекальциферол;

Д₄ – дегідроергокальциферол;

2) синтетичних: Д₅, Д₆, Д₇.

Природні та синтетичні кальцифероли є аналогами природного вітаміну Д₃ відрізняються від нього боковим аліфатичним ланцюгом у 17-му положенні.

Апаратура: газовий пальник.

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. концентрована соляна кислота; 2. анілін; 3. вітамінізований риб'ячий жир.

Принцип методу.

При нагріванні хлороформного розчину вітаміну D або риб’ячого жиру із сумішшю аніліну та концентрованої соляної кислоти розчин забарвлюється у червоний колір.

Хід роботи. В суху пробірку наливають 1 мл вітамінізованого риб’ячого жиру, додають до нього 5 мл аніліну і 0,5 мл концентрованої соляної кислоти. Після перемішування утворюється емульсія жовтого кольору. Вміст пробірки нагрівають на відкритому полум’ї до кипіння протягом 0,5 хв. Емульсія забарвлюється в червоний колір.

4.3. Якісне визначення рибофлавіну.

Рибофлавін (вітамін В₂) за хімічною природою являє собою диметилзаміщену похідну ізоалоксазину, зв'язаного в положенні 9 із залишком п'ятиатомного спирту рибіту. Рибофлавін, зв’язаний з фосфорною кислотою, входить до складу флавінових ферментів.

При відновленні вітамін В₂ (має жовтий колір) спочатку переходить в проміжну сполуку червоного кольору, а потім – у безбарвний лейкофлавін. У кислому середовищі вітамін В₂ стійкий, а у лужному середовищі – руйнується

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. Концентрована соляна кислота; 2. Металевий цинк; 3. 0,025%-й розчин вітаміну В₂ (суспензія рибофлавіну у воді).

Принцип реакції. Водень, що утворюється при додаванні металевого цинку до концентрованої соляної кислоти, відновлює жовтий рибофлавін спочатку в родофлавін (проміжна сполука) червоного кольору, а потім у безбарвний лейкофлавін.

Хід роботи. В пробірку налити 1,5 мл 0,025%–го розчину рибофлавіну і 1 мл концентрованої соляної кислоти, потім опустити кілька гранул металевого цинку. Водень, що виділяється, реагує з рибофлавіном, відновлюючи його, і рідина поступово забарвлюється в рожевий колір, а потім знебарвлюється. Якщо рідина залишається червоною, необхідно ще додати гранулу металевого цинку.

При збовтуванні знебарвленого розчину лейкофлавін знову окисляється киснем повітря в рибофлавін.

4.4. Кількісне визначення вітаміну С у рослинній сировині.

Апаратура: ваги лабораторні.

Лабораторний посуд: ступка порцелянова, лійки скляні, колби конічні, бюретки для титрування, скляні палички, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. 2,0%-й розчин соляної кислоти; 2. 0,0005 М розчин дихлорфеноліндофенолу; 3. Скляний пісок; 4. Фільтрувальний папір.

Принцип методу грунтується на здатності аскорбінової кислоти окислюватися 2,6-дихлорфеноліндофенолом до дегідроаскорбінової кислоти. За кількістю 2,6-дихлорфеноліндофенолу, витраченого на титрування, визначають кількість аскорбінової кислоти в дослідному матеріалі. Як тільки вся кількість вітаміну С окислиться, розчин, що відтитровують, здобуває рожеве забарвлення за рахунок утворення недисоційованих молекул 2,6-дихлорфеноліндофенолу (у кислому середовищі). У лужному середовищі 2,6-дихлорфеноліндофенол має синє забарвлення, у кислому – червоне, а при відновлення знебарвлюється.

Хід роботи. 1 г продукту (картопля, капуста тощо) старанно розтирають у фарфоровій ступці із скляним піском. До розтертої маси додають 9 мл 2,0%–го розчину соляної кислоти. Через 10 хв вміст перемішують і фільтрують.

Для кількісного визначення відбирають 3 мл фільтрату.у конічну колбу і титрують розчином 2,6–дихлорфеноліндофенолу до появи рожевого забарвлення, яке зберігається протягом 30 с.

Кількість аскорбінової кислоти розраховують за формулою:

де Q – кількість аскорбінової кислоти, що відповідав 1 мл 0,0005 М розчину 2,6–дихлорфеноліндофенолу – 0,088 мг; А – кількість 0,0005 М розчину 2,6–дихлорфеноліндофенолу, що пішов на титрування, мл; V_o – загальний об'єм екстракту, мл; V₁ – об'єм екстракту, взятий для титрування, мл; a – кількість продукту, г.

4.5. Визначення вітаміну С в молоці.

Лабораторний посуд: колби конічні, бюретки для титрування, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. молоко; 2. 2,0%-й розчин соляної кислоти; 3. 0,001 н. розчин 2,6–дихлорфеноліндофенолу.

Хід роботи. У конічну колбу на 100 мл відмірюють піпеткою 5 мл молока і 10 мл дистильованої води. В дві колби на 25–50 мл вносять піпеткою по 5 мл приготовленої суміші, 9 мл дистильованої води і 1 мл 2,0%-го розчину HCl ретельно переміщують і титрують 0,001 н. розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу до слабо–рожевого забарвлення, яке не зникає протягом 30–60 с.

Вміст аскорбінової кислоти розраховують за формулою:

де А – кількість 0,001 н. розчину 2,6–дихлорфеноліндофенолу, що пішов на титрування, мл; К – поправка на титр індикатору; 5,28 – постійний коефіцієнт.

5. Ферменти: специфічність та активність дії.

5.1. Визначення специфічності дії ферментів

Ферменти відрізняються від неорганічних каталізаторів високою специфічністю.

Під специфічністю дії ферментів розуміють відповідну спрямованість їх впливу на певний субстрат, групу субстратів, близьких за своїми властивостями, або певний тип зв’язку. Залежно від цього розрізняють абсолютну, групову і стереохімічну (просторову) специфічність ферментів.

Абсолютна специфічність - характерна для ферментів, які каталізують лише одну реакцію і діють на один точно визначений субстрат. Наприклад, уреаза діє лише на сечовину і не діє на похідні сечовини, напр. метилсечовину; аргіназа, розщепляє аргінін.

Абсолютно групова специфічність – здатність ферментів діяти на певний тип хімічного зв’язку, утворений певними радікалами (атомними групами). Так, пепсин гідролітично розщеплює пептидний звязок, утворений аміногрупами тирозину та фенілаланіну; карбоксипептидаза відщеплює в пептидах з С-кінця майже всі амінокислоти.

Відносно групова специфічність (специфічність за типом зв’язку) – здатність ферменту діяти на певний тип хімічного звязку, утворений радікалами будь-якої хімічної будови. До таких ферментів належать ліпази та естерази, що розщеплюють не тільки різні триацилгліцериди, а й ді- та моноацилгліцериди та інші складні ефіри.

Оптична або с тереохімічна специфічність – здатність ферменту діяти лише на одину стереоізомерну форму субстрату. Так, b-Д-глюкозооксидаза, діє лише на b-Д-глюкозу.

Специфічність ферментів можна спостерігати на прикладі уреази, амілази і пепсину.

Принцип методу. Під дією уреази на сечовину утворюється двооксид вуглецю та аміак, який зміщує реакцію середовища в лужний бік, що визначають з допомогою індикатору фенолфталеїну.

Амілази каталізують гідролітичне розщеплення крохмалю до мальтози і декстринів. Найбільш вивченими є α і β–амілази: α–амілаза розщеплює амілозу і амілопектин безладно на велику кількість низькомолекулярних декстринів та незначну кількість мальтози; β–амілаза каталізує гідролітичне розщеплення кожного другого глікозидного зв'язку амілози з утворенням 100% мальтози і розщепленням кожного другого глікозидного зв'язку амілопектину до розгалуження з утворенням мальтози і незначної кількості високомолекулярних декстринів. Таким чином, дію амілази можна визначити за зникненням синього забарвлення розчину крохмалю в присутності йоду.

Пепсин каталізує гідролітичне розщеплення пептидних зв’язків білків молока, що зумовлює його зсідання.

Хід роботи. Готують дев’ять чистих пробірок. В перші три наливають по 5 мл 0,1%-го розчину крохмалю, у наступні три – по 5 мл 1,0%-го розчину сечовини і по 3 краплі 1,0%-го розчину фенолфталеїну, а в решту пробірок – по 5 мл молока. Пробірки групують по три. В кожній трійці знаходяться пробірки з різним субстратом – з крохмалем, сечовиною і молоком. В першу трійку вносять по 1 мл уреази, в другу – по 1 мл розчину амілази, в третю по 1 мл 1,0%-го розчину пепсину. Всі пробірки витримують протягом 15 хв. при 37 °С, після чого перевіряють у них дію ферментів. У пробірки з крохмалем додають по краплинах 1,0%-й розчин йоду в йодиді калію. Відмічають зміну забарвлення в пробірках з крохмалем і сечовиною під дією відповідно амілази та уреази.

Реактиви: 1. 0,1%-й розчин крохмалю; 2. 1,0%-й розчин пепсину; 3. Розчин уреази, 4. Амілаза солоду або розбавленої водою слини (1:20); 5. 1,0%-й розчин сечовини; 6. 1,0%-й розчин фенолфталеїну; 7. 1,0%-й розчин йоду в йодиді калію.

5.2. Визначення залежності дії ферментів від температури і рН середовища

Ферменти чутливі до температури. Температура, при якій фермент має максимальну активність, називається оптимальною температурою ферменту. Температурний оптимум дії більшості ферментів тваринного походження складає 37–50°С, а рослинного – 40–60°С. При нагріванні вище оптимальної температури активність ферментів знижується і при 80°С більшість ферментів інактивується внаслідок денатурації. При температурах нижче 0°С дія ферментів уповільнюється.

Ферменти чутливі до рН середовища. Концентрація водневих іонів діє на активний центр ферментів, на ступінь його іонізації, а також на іонізацію субстрату, фермент-субстратного комплексу і продуктів реакції. Це впливає на структуру, стан ферментного білка і швидкість реакції. Для кожного ферменту існує оптимальне значення рН. Незначне відхилення рН від оптимального значення уповільнює або зупиняє дію ферментів.

Принцип методу грунтується на різному забарвленні розчину крохмалю йодом, яке залежить від ступеня його гідролізу амілазою при різних значеннях температури і рН середовища.

Хід роботи. В чотири пробірки наливають по 5 мл 0,1%-го розчину крохмалю. Пробірки витримують по 10 хв. при відповідних температурах: першу і четверту – при 20°С, другу – при 0°С, третю – при 37°С. Потім у першу, другу і третю пробірки додають по 1 мл солоду, а в четверту – 1 мл цього ж розчину солоду, але прокип’яченого. Витримують пробірки протягом 30 хв. при цих же температурах і потім додають по 1–2 краплини 1,0%-го розчину йоду в йодиді калію. Забарвлення розчинів у пробірках порівнюють і роблять висновки про вплив температури на дію ферментів.

У три пробірки з 1 мл розбавленої слини чи розчину солоду наливають: в першу – 1 мл 1,0 н. розчину соляної кислоти і 5 мл 0,1%-го розчину крохмалю, в другу – 5 мл 0,1%-го розчину крохмалю, в третю – 1 мл 1,0 н. гідроксиду натрію і 5 мл 0,1%-го розчину крохмалю. Після витримки пробірок при 37°С протягом 30 хв. у них додають, при помішуванні, по 5 краплин розчину йоду в йодиді калію. Порівнюють забарвлення розчинів у пробірках. У пробірках з кислотою і лугом амілаза буде інактивована, і забарвлення розчину не зміниться.

Реактиви: 1. 0,1%-й розчин крохмалю; 2. Розчин солоду або розбавленої водою слини (1:20); 3. 1,0%-й розчин йоду в йодиді калію; 4. 0,1%-й розчин крохмалю в 0,1%-му розчині хлористого натрію; 5. 1.0 н. розчин соляної кислоти; 6. 1,0 н. розчин гідроксиду натрію.

5.3. Вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази.

Принцип методу. Активатором амілази є хлорид натрію, а інгібітором – сульфат міді. Ступінь гідролізу крохмалю під впливом амілази буде різним в присутності цих речовин.

Хід роботи. Готують розчин слини; відміряють циліндром 50 мл дистильованої води і полощуть нею рот протягом 3–5 хвилин у кілька прийомів. Одержану рідину фільтрують через вату і фільтрат використовують. Беруть три пробірки. В першу наливають 2,5 мл води, в другу – 2 мл води і 0,5мл 1%-го розчину хлориду натрію, в третю – 2 мл води і 0,5 мл 1%-го розчину сульфату міді. У всі пробірки вносять по 2,5 мл розчину слини і додають по 2,5 мл 0,5% розчину крохмалю; знову перемішують і ставлять у термостат при температурі 38°С. Через 5 хвилин пробірки виймають і перевіряють ступінь гідролізу крохмалю, додаючи у всі пробірки по 5 крапель розчину йоду. Рідина у першій пробірці забарвлюється у фіолетовий або червоний колір, у другій – у червоний або жовтий, в третій – у синій. Результати свідчать про те, що найкраще гідроліз крохмалю проходить у другій пробірці (хлорид натрію – активатор амілази), а найгірше – у третій (сульфат міді – інгібітор амілази).

Реактиви: 1. Розчин слини (готують студенти перед роботою); 2. 0,5%-й розчин крохмалю; 3. 0,1%-й розчин йоду в 0,2%-му розчині йодиду калію; 4. 1%-й розчин NaCl; 5. 1%-й розчин CuSO₄.

5.4. Якісне визначення β-фруктофуранозидази.

Фермент β–фруктофуранозидаза (інвертаза, сахараза) належить до класу гідролаз. Він каталізує гідролітичне розтоплення вуглеводів, які містять фруктозу у b–формі, розщеплюючи β–фруктозидний зв’язок (сахарозу, рафінозу).

Гідроліз сахарози супроводжується утворенням α–глюкози і β–фруктози. Цей фермент має значне поширення в природі, особливо активний він у дріжджах. Інвертаза знаходить застосування в кондитерській промисловості, оскільки утворений під її дією інверсний цукор перешкоджає кристалізації сахарози в кондитерських виробах.

Принцип методу. Наявність β-фруктозидази визначають за редукуючим цукром, який утворюється під час ферментативного гідролізу сахарози. Альдегідна група редукуючого цукру реагує з гідроксидом міді Cu(OH)₂. Редукуючі цукри при цьому окислюються у відповідні кислоти, а голубий гідрат окису міді відновлюється в жовтий гідрат закису міді СuОН.

Фруктоза в розчині Фелінга переходить в альдозу під дією лугу та окислюється в кислоту, яка містить на один атом вуглецю менше, ніж вихідний цукор.

Реакцію відновлення міді та окислення альдегідної групи цукру можна подати таким чином, що альдегідна група редукуючого цукру окислюється в кислоту: R–COH + O ® R–COOH за рахунок кисню гідрату окису міді

2Cu(OH)₂ ® 2CuOH + O + H₂O

При нагріванні: 2CuOH ® H₂O + Cu₂O

Хід роботи. 5 г свіжих пресованих дріжджів вміщують у фарфорову ступку, куди додають 3 г добре промитого дрібного піску. Потім додають 2 мл води і розтирають протягом 5 хв. У розтерту масу в кілька прийомів приливають, при ретельному перемішуванні, ще 10 мл дистильованої води. Суміш залишають стояти протягом 20 хв. у термостаті при 25–30°С і час від часу струшують. Суміш центрифугують, центрифугат іноді дає опалесценцію, що пояснюється вмістом у ньому деякої кількості глікогену.

В дві пробірки наливають по 5 мл розчину сахарози в буфері. Потім швидко приливають по 1 мл центрифугату екстракту інвертази: в одну пробірку – некип'яченого, в другу – попередньо прокип'яченого протягом 5 хв. і охолодженого. Суміші ставлять на 30 хв. у термостат при 40°С. Після вказаного терміну інкубації приливають по 2 мл фелінгового розчину (по 1 мл розчинів І і ІІ). Рідину в пробірках кип'ятять. Там, де був доданий кип'ячений центрифугат, осад закису міді майже не випадає. В окремих випадках може спостерігатися незначний червоний наліт на дні пробірки: це пояснюється тим, що розчин сахарози містить деяку кількість редукуючих цукрів, або тим, що в ферментному екстракті можуть також міститися редукуючі речовини. В другій пробірці, де фермент активний, випадає значний червоний осад закису міді, який свідчить про ферментативне розщеплення сахарози.

Паралельно рекомендують поставити ще один дослід на специфічність інвертази. В третю пробірку наливають як субстрат не тростинний цукор, а 5 мл 1%-го розчину крохмалю у воді і додають 1 мл некип'яченого центрифугату. Суміш інкубують у термостаті при температурі 40°С. Потім додають 2 мл фелінгової рідини, по 1 мл розчинів І і ІІ, кип'ятять і спостерігають за процесом. У цьому випадку осаду закису міді не буде, що вказує на специфічну дію сахарози.

Реактиви: 1. Розчин тростинного цукру в буфері (рН 4,5): В колбу місткістю 1 л наливають 50 мл нормального розчину оцтовокислого натрію та 50 мл нормального розчину оцтової кислоти і доводять водою до мітки. В мірній колбі місткістю 1 л розчиняють буферною сумішшю 100 г тростинного цукру і доводять вміст колби цією ж сумішшю до мітки. Розчин зберігають на холоді (2–4°С) або консервують толуолом, додаючи його близько 1 мл; 2. Реактив Фелінга: Розчин І. 40 г перекристалізованої сірчанокислої міді розчиняють у мірній колбі місткістю 1 л і доводять водою до мітки. Розчин П. 200 г сегнетової солі (подвійна сіль калію) і натрію винної кислоти KNaC₄H₄O₆´4H₂O і 150 г хімічно чистого їдкого натру розчиняють у мірній колбі місткістю 1 л і доводять водою до мітки. Розчини І і П при проведенні реакції приливають в однакових кількостях; 3. 1,0%-й розчин крохмалю у воді.

5.5. Визначення амілолітичної активності.

Амілази каталізують гідроліз високомолекулярних полісахаридів крохмалю і глікогену. Найважливішим джерелом амілаз є злакові, які містять їх як у непророщеному, так і (особливо багато) в пророщеному зерні. В останньому випадку амілази мають високу активність.

Широке застосування амілази знаходять у крохмало–патоковому, спиртовому, пивоварному і хлібопекарному виробництвах як головні ферменти, що каталізують процеси розщеплення крохмалю й утворення бродильного цукру.

Амілолітична активність характеризує здатність ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом. Метод характеризує активність α-амілази, але при наявності в препараті β-амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів.

За одиницю амілолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, яка каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом за 1 год при 30°С у чітко визначених умовах.

Амілолітичну здатність препарату (АЗ) виражають числом указаних одиниць в 1 г сухого препарату чи в 1 мл розчину. При такому способі вираження АЗ безпосередньо показує, скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до нездатних забарвлюватися йодом декстринів 1 г препарату, культури чи 1 мл розчину за 1 год (в умовах, аналогічних умовам визначення).

Принцип методу грунтуєтьсяна гідролізі 1,0%-го буферного розчину крохмалю. Кінець реакції контролюється візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату,

Хід роботи. В конічну колбуна 50–100 мл вносять піпеткою 20 мл1,0%-го розчину крохмалю і поміщають у термостат з температурою 30°С. Загальний об'єм реакційної суміші завжди повинен бути рівний 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, об’єм, кого нестає доповнюість дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

Через 10 хв витримки в термостаті в колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно за секундоміром відмічають час.

За початок реакції приймають час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хвилину після початку реакції або частіше скляною паличкою відбирають краплину суміші і на білій порцеляновій пластинці з'єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду.

Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане змінювати забарвлення на синє при з’єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с).

Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв., але більш надійні результати отримують у межах від 5 до 15 хв. Всі піпетки, які використовуються при аналізі, повинні мати ватні тампони (для запобігання попадання слідів слини).

Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв., то визначення повторюють з меншою кількістю розчину ферменту, наприклад – 2 мл. У цьому випадку в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 3 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1г в 200 або 500 мл).

Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв., то готують розчин ферменту більшої концентрації, наприклад, 1:50 чи 1:100, а рідину можна нерозбавляти зовсім.

При часі зникнення забарвлення в межах 3–5 хв. проби відбирають кожні 15 с; 5–10 хв. – кожні 30 с; а більше 10 хв. – кожну хвилину.

Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником.

Розрахунок амілолітичної активності (амілолітичної здатності – А3)

Розрахунок АЗ проводиться за формулою:

де 0,2 – кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 – коефіцієнт перерахунку на 1 год; а – кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш у грамах абсолютно сухої речовини або мілілітрах рідинного об'єкта; t – час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом продуктів, хв; 1 – перерахунок на 1 г абсолютно сухого препарату або 1 мл розчину.

Приклад розрахунку. Для аналізу беруть 5 мл ферментного розчину з розбавленням 1:2000, що відповідає 0,0026 г препарату

.

Забарвлення з йодом зникає через 6,5 хв., тоді за формулою:

Реактиви: 1. 1,0%-й розчин розчинного крохмалю (картопляного). Наважку беруть з такого розрахунку, щоб в 100 мл розчину був 1 г сухого крохмалю. Наважку крохмалю кількісно переносять у велику склянку з киплячою водою, кип’ятять 2 хв. й охолоджують, весь час перемішуючи розчин скляною паличкою. Охолоджений крохмаль переносять у мірну колбу того об’єму, з розрахунку на який взята наважка крохмалю, додають буферний розчин (2) в кількості 10 мл на 100 мл розчину і доводять до мітки дистильованою водою. Розчин крохмалю готують у день аналізу; 2. буферний розчин: змішують рівні об’єми нормальних розчинів оцтової кислоти (58 мл льодяної оцтової кислоти в 1 л дистильованої води (оцтовокислого натрію) 82 г СH₃СООNа або 136 г CH₃COONa´3H₂О в 1 л води), рН = 4,7; 3. Робочий розчин йоду (1,4 г кристалічного йоду і 4,4 г йодистого калію розчиняють у малому об’ємі води, та об’єм розчину доводять до 100 мл., зберігають у темному місці); 4. робочий розчин йоду готують в день аналізу (20 мл основного розчину йоду доводять дистильованою водою до 100 мл і на кожні 100 мл робочого розчину додають 4 г йодистого калію); 5. розчин ферменту: а) Для технічного ферментного препарату (культура гриба) із ретельно подрібненої абсолютно сухої середньої проби беруть у колбу на 200–300 мл наважку 1 г (з точністю до 0,01), додають піпеткою 50–100 мл дистильованої води і настоюють протягом 1 год. при кімнатній температурі, перемішуючи через кожні 10 хв.; по закінченні 1 год. розчин фільтрують через складчастий фільтр; б) Для очищених ферментних препаратів: на аналітичних вагах беруть наважку середньої проби тонко подрібненого препарату в 0,1 г. Препарат ретельно розтирають скляною паличкою в невеликій кількості води, потім переносять в мірну колбу на 100 мл і доводять дистильованою водою до риски; розчин фільтрують.

5.6. Визначення протеолітичної активності.

Важливим етапом технології багатьох харчових виробництв в біохімічні перетворення білків, які відбуваються під дією протеолітичних ферментів. В основі визначення протеолітичної активності лежать різні принципи: зміна фізико-хімічних властивостей субстратів, визначення зменшення субстрату, облік кількості продуктів протеолізу.

Контроль за зменшенням субстрату дозволяє судити про активність протеїназ, оскільки при цьому визначається кількість непрогідролізованого білка. Тому метод можна використовувати для препаратів, які застосовуються в різних галузях промисловості.

Принцип методу полягає в гідролізі казеїну відомою кількістю ферментного препарату і визначенні ступеня розщеплення білка за зменшенням кількості соляної кислоти, що зв'язується непрогідролізованим казеїном. Після ферментної дії протягом 1 год. у досліді і перед доданням такої ж кількості ферментного екстракту в контролі ферментативну реакцію зупиняють 0,1 н. розчином соляної кислоти. Осади фільтрують, а 10 мл фільтрату титрують 0,1 н. розчином NaOH. Кількість NaOH, що пішла на титрування в дослідній та контрольній пробах, береться за міру протеолітичної активності об'єкта, що піддають аналізу.

Цей метод є досить простим і зручним у роботі. За одиницю активності прийнята кількість ферменту, яка за 1 год. при 30°С каталізує гідроліз 1 г казеїну.