Схема патогенеза менингококковой инфекции

Мазок препарата «толстая капля» крови. Данное исследование выполняется у постели больного при поступлении его в стационар. Окраску мазка производят 1% водно-спиртовым раствором метиленовой сини в течение 2–3 минут без предварительной фиксации.

Бактериологический метод. Этот метод диагностики является основным. Он позволяет подтвердить бактериоскопическую диагностику путем выделения чистой культуры, а также определить серологическую группу менингококка, что облегчает проведение эпидемиологического анализа и противоэпидемических мероприятий.

а) исследование спинномозговой жидкости

Менингококки очень требовательны к условиям культивирования, растут на средах с добавлением нативного белка. Наиболее часто используют «шоколадный агар». Посев производят на свежеприготовленную среду, предварительно подогретую в термостате (первый день исследования). После проведения пункции непосредственно из пункционной иглы выполняют посев СМЖ на чашку с «шоколадным» агаром. Чашку осторожно открывают и на поверхность среды закапывают несколько капель ликвора (3–4 капли). И с помощью нескольких круговых движений чашки по поверхности стола капли ликвора распределяются по поверхности агара. Посев СМЖ в пробирку с 0,1% полужидким сывороточным агаром должен проводиться сразу после пункции. Для этого из пункционной иглы 6 капель СМЖ вносят в пробирку с 5 мл 0,1 % полужидким сывороточным агаром, используя его как среду накопления. Посев СМЖ в 5 мл 0,1 % полужидкий агар можно производить в лаборатории. Посевы инкубируют при повышенной влажности, в атмосфере, содержащей 5–10% углекислого газа, так как это стимулирует рост менингококков.

Через 18–20 часов (второй день исследования) посевы просматривают визуально, лучше при помощи стереоскопического микроскопа. На «шоколадном» агаре менингококки растут в виде нежных полупрозрачных сероватых колоний с идеально ровными краями, блестящей поверхностью, диаметром 1–2 мм. Имеют маслянистую консистенцию, не изменяют цвета среды и не имеют запаха. Как правило, из спинно-мозговой жидкости высевается чистая культура менингококка, 2–3 колонии которой отсевают на сывороточный агар для идентификации, определения серогруппы и чувствительности к антибиотикам.

На третий день исследования выросшие культуры просматривают, определяют чистоту в мазках, окрашенных метиленовой синью. Определяют каталазную и оксидазную активность, ферментативную активность на пестром ряду, состоящем из глюкозы, мальтозы, сахарозы и лактозы. Для уточнения биохимических свойств менингококков используют тест-системы, позволяющие в течение 2 часов определить видовую принадлежность возбудителя. К тест-системам относят APINH (производства Франция) для выполнения расширенной идентификации бактерий родов – Neisseria, Haemophilus, Bronhamellacatarrhalis и определения фермента пенициллиназы.

Определение серологической группы проводят в реакции агглютинации с диагностическими сыворотками. Для постановки реакции на стекло наносят по капле неразведенных сывороток А, В, С, X, Y, Z, W-135, 29E и каплю физиологического раствора для контроля. К каждой капле добавляют петлю выделенной культуры, прожигая петлю после каждой капли. Там, где антигены культуры соответствуют антителам сыворотки, наступит агглютинация. Если на чашке с посевом материала нет роста, то производят высев из cреды накопления. Отрицательный ответ выдают в том случае, если и этот посев не дает роста подозрительных колоний. Определение серогруппы можно проводить в реакции преципитации в геле.

б) исследование крови

Кровь засевают у постели больного во флакон, с «двухфазной» питательной средой в соотношении крови к жидкой фазе 1:10, помещают в термостат при температуре 37 градусов на 18–20 часов. После этого делают высев на чашки с сывороточным агаром для выделения чистой культуры. Посевы инкубируют 18–20 часов, если после этого на чашках отсутствует рост, посев крови продолжают инкубировать 5 дней, делая каждые 2 дня пересевы на «шоколадный» агар. Если же на «шоколадном» агаре вырастают подозрительные колонии, то 2–3 из них выделяют на сывороточный агар и дальнейшее исследование ведут, как и при выделении культуры из спинномозговой жидкости.

в) исследование отделяемого носоглотки

Носоглоточную слизь засевают сразу же после взятия или доставляют на тампонах в лабораторию, где проводят посев. Учитывая, что в слизи носоглотки могут содержаться грамположительные кокки, для посева используют элективные среды. В качестве элективной среды, на которой задерживается рост грамположительных кокков, используют сывороточный агар с антибиотиком (ристомицин, линкомицин) и без антибиотика. Посевы помещают в термостат на 18–20 часов при температуре 37 градусов. Для ускоренного роста менингококков посевы инкубируют в повышенной концентрации углекислого газа (5–10%).

На 2–5 день отбирают подозрительные оксидазоположительные колонии и 2–3 из них пересевают на сывороточный агар, без антибиотиков. На сывороточном агаре выглядят как мелкие, прозрачные, голубоватые в проходящем свете колонии, не склонные к слиянию. Визуально трудно отличить колонии N.meningitidis от B.сatarrhalis. Дифференциация проводится по способности к росту бронхамелл при комнатной температуре (22 ^о) и на бессывороточных средах.

Выделение чистой культуры из носоглоточной слизи связано с определенными трудностями, так как на чашке вырастают и другие представители непатогенных нейссерий, бронхамелл и ацинетобактеры. Выделенные культуры дифференцируют по культуральным и биохимическим свойствам (табл.15). Для дальнейшего исследования оставляют те культуры, которые на сывороточной среде дают нежный беспигментный рост. Выделенные культуры высевают на простой агар, который помещают в термостат при температуре 37 градусов и на сывороточный агар, который оставляют при комнатной температуре. Непатогенные нейссерии растут в этих условиях, а менингококки роста не дают. Биохимическую активность определяют на средах Гисса, к которым добавляют сыворотку. После суточного инкубирования учитывают результат на N.meningitidis каталазо- и оксидазоположительные.

Определение серогруппы чистой культуры проводят так же, как и при исследовании спинномозговой жидкости.

Серологический метод. Метод основан на обнаружении антител в парных сыворотках крови. Антитела определяют в РНГА, используя как антиген, эритроциты барана, обработанные группоспецифическими полисахаридами. Следует отметить, однако, что этот метод большого диагностического значения не имеет. Метод позволяет провести ретроспективную лабораторную диагностику генерализованых форм менингококковой инфекции (менингококкцемии).

Методы ускоренной диагностики менингита. В качестве экспресс-диагностики при подозрении на менингит определяют присутствие менингококкового антигена в спинномозговой жидкости латекс-агглютинации, в реакции встречного иммуноэлектрофореза или радиоиммунным методом.

Латекс-агглютинация. Позволяет в течение 15 мин. дать ответ об отсутствии или наличии в СМЖ больного специфических антигенов. Например, наиболее распространенной латекс-тест-системой является Slidexmeningite – Kit 5 (Франция). В набор входят следующие реагенты:

R1 – H.influenzae тип b, латекс;

R2 – S.pneumoniae тип omni, латекс;

R3 – N.meningitides группа А, латекс;

R4 – N.meningitides группа В / E.coli, латекс;

R5 – N.meningitides группа С, латекс;

R6 – положительный контроль, содержащий антигенные экстракты из H.influenzae типа b, S.pneumoniae, N. meningitides групп А,В,С/ E.coli. Одну каплю каждого латексного реактива наносят на специальные бумажные карты. Затем добавляют 30 мкл СМЖ (надосадочная фракция) к каждой латексного реактива. Агглютинация в течение 2 минут с одним из латекс-диагностических препаратов свидетельствует о присутствии в СМЖ специфического антигена.

Таблица 15