| Ингредиенты (мл) | № пробирок | ||
| контроль | |||
| Испытуемая инактивированная сыворотка крови, разведенная 1:5 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| Положительная инактивированная сыворотка крови, разведенная 1:5 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| Слабоположительная инактивированная сыворотка крови, разведенная 1:5 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| Отрицательная инактивированная сыворотка крови, разведенная 1:5 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| Антиген трепонемный, разведенный по титру | 0,25 | - | - |
| Антиген кардиолипиновый, разведенный по титру | - | 0,25 | - |
| Изотонический раствор натрия хлорида | 0,25 | ||
| Комплемент, разведенный по рабочей дозе | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут | |||
| Гемолитическая система | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45–60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке |
Исследование каждой испытуемой сыворотки крови человека проводят в трех пробирках с двумя антигенами (таблица 22). Одновременно исследуют для контроля заведомо положительные (4+, 2+) и отрицательную сыворотки крови. Сыворотки крови положительные и слабоположительные получают из крови кроликов, зараженных патогенными бледными трепонемами (штамм Никольса), отрицательные – из крови здоровых кроликов. Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1:5 изотоническим раствором натрия хлорида, разливают по 0,25 мл в три пробирки, из которых третья является контрольной. В первую пробирку добавляют 0,25 мл трепонемного антигена, во вторую – 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенных по титру. В третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. После первичной 45-минутной инкубации в термостате при 37° добавляют во все пробирки по 0,5 мл гемолитической системы. Легким встряхиванием перемешивают содержимое пробирок и помещают их в термостат при 37° на 45–50 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке. Регистрируют результат реакции по наличию или отсутствию гемолиза в опытных пробирках.
Оценка результатов. Для обозначения степени позитивности реакции Вассермана пользуются системой четырех плюсов:
- полная задержка гемолиза – 4+ (резко положительная реакция);
- значительная задержка гемолиза – 3+ (положительная реакция);
- частичная задержка гемолиза – 2+ (слабоположительная реакция); - незначительная задержка гемолиза – 1+;
- сомнительная реакция – +/-.
Отрицательный результат реакции характеризуется полным гемолизом во всех пробирках опыта.
Оценку результатов регистрируют в книге протоколов лаборатории. Результаты реакции следует давать по каждому антигену отдельно. В случае расхождения результатов между антигенами необходимо повторное исследование новой порции сыворотки крови; повторное исследование необходимо также при наличии задержки гемолиза в контроле сыворотки крови (третья пробирка, не содержащая антигена).
Правильность течения опыта оценивают на основании следующих результатов:
1) контроля испытуемой сыворотки крови – третий ряд пробирок (отрицательный);
2) контроля с заведомо отрицательной сывороткой крови (отрицательный);
3) контроля с заведомо положительной (3+ или 4+) и слабоположительной (2+) сыворотками крови.
Количественная методика постановки реакции Вассермана
Определение титра реагинов и противотрепонемных антител в положительных сыворотках крови производится путем исследования в реакции связывания комплемента уменьшающихся объемов сыворотки крови, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида. Количественный метод постановки реакции Вассермана ставят с положительными сыворотками крови, давшими 4+ с кардиолипиновым или трепонемным антигенами.
Сыворотки крови повторно инактивируют 15 минут при 56° в инактиваторе. Каждую сыворотку крови исследуют в 8 пробирках (таблица 23). В первую пробирку наливают 0,8 мл изотонического раствора натрия хлорида, со второй по 7-ю пробирку – по 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку вносят 0,2 мл испытуемой сыворотки крови, содержимое перемешивают, затем 0,25 мл удаляют, а по 0,25 мл переносят во вторую и восьмую пробирки. После перемешивания переносят 0,25 мл из второй пробирки в третью, из третьей – в четвертую и т.д. до седьмой пробирки, из которой 0,25 мл разведенной сыворотки крови удаляют. Получают разведения сыворотки крови: 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:5. Затем приливают по 0,25 мл кардиолипинового антигена, разведенного по титру, с первой по седьмую, а в 8-ю пробирку 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. После легкого встряхивания во все пробирки приливают по 0,25 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Первичная инкубация в термостате при 37° продолжается 45 минут, после чего во все пробирки приливают по 0,5 мл гемолитической системы. Встряхнув пробирки, их помещают в термостат при 37° на 45–60 минут и после наступления полного гемолиза в восьмой (контрольной) пробирке регистрируют результаты реакции.
Количественное определение реагинов имеет значение при оценке эффективности противосифилитического лечения. Быстрое снижение титра реагинов свидетельствует об успешности терапии. Длительно не снижающийся титр реагинов указывает на отсутствие эффективности терапии и необходимость ее изменения.
Таблица 23
