Целью контроля является обнаружение живых микробов в ГЛФ противомикробных препаратов, которые отнесены к категории стерильных. Испытание на стерильность проводят в асептических условиях: в боксах, в стерильной одежде, обработанными антисептиками руками, используя стерильные инструменты, посуду и среды. Для малых объёмов испытуемого препарата обычно используют метод прямого посева, для больших объёмов - метод мембранных фильтров. В том и другом случае посев проводят на одни и те же стандартные среды, которыми являются:
· жидкая тиогликолевая среда, рН 7,2 (для аэробных и анаэробных бактерий)
· жидкая среда Сабуро, рН 5,6 (для грибов).
Обе среды стерилизуют 15 мин насыщенным паром при температуре 121оС.
Метод прямого посева. Испытуемый лекарственный препарат засевают в стерильные колбы (пробирки) со средами в соотношении 1:10, исходя из объёма контролируемой единицы ГЛФ: при объёме менее 1 мл засевают весь объём, 1-4 мл - 1 мл; 5-19 мл - 2 мл; 20-100 мл - 2-4 мл; более 100 мл - 10 мл. Одновременно ставят контроль на нейтрализацию противомикробного вещества разведением, для чего в посевы таких же объёмов и тех же сред вносят по 0,1 мл взвеси суточных культур (посевная доза около 1000 бактерий) тест-штаммов золотистого стафилококка, кишечной палочки и сенной бациллы. Посевы инкубируют 14 дней: тиогликолевую среду - при 3-35оС, среду Сабуро - при 20-25оС. По мере помутнения среды или в конце инкубации (14 день) делают высев на среды с последующим приготовлением мазка и окраской его по методу Грама. Если после 14-дневной инкубации в опытных колбах (пробирках) нет микроорганизмов, а в контроле нейтрализации есть рост, то испытуемый препарат считается стерильным; при наличии роста в опытных и контрольных посевах испытуемый препарат оценивается как нестерильный. При испытании на стерильность мазей, паст, гелей, эмульсий на жировой основе, а также растворов препаратов в маслах, образец (0,1 мл (г)) асептически отобранного испытуемого препарата вносят в колбы, содержащие стеклянные бусы, 100 мл 1/15 М фосфатного буфера и эмульгатор твин-80 в концентрации 2,5%. Содержимое колб подогревают до 41оС, встряхивают до получения однородной эмульсии, после чего по 5 мл полученной эмульсии вносят в колбы с 40 мл тиогликолевой среды и среды Сабуро. Дальнейший ход исследования и оценка такие же, как при испытании растворов. Методика санитарного и внутреннего контроля за микробной контаминацией нестерильных противомикробных препаратов. Согласно Госфармакопее, выпускаемые в ЛПО нестерильные лекарственные средства не должны содержать представителей семейства энтеробактерий, золотистых стафилококков и синегнойных бактерий в объёме 10 мл. В препаратах, предназначенных для применения на коже, допускается присутствие не более 200 сапрофитических бактерий в 1 г (мл); в препаратах перорального применения - не более 1000 бактерий и 100 грибов в 1 мл (г). Такие же требования предъявляются при осуществлении текущего и санитарного контроля. Имеются дополнительные требования к ГЛФ для детей.
Подготовка препарата к исследованию. Для испытания образец препарата готовят в форме раствора, суспензии или эмульсии. Твёрдые ГЛФ (порошки, таблетки, драже и др.) измельчают и разводят в стерильном фосфатном буфере 1:10. Жидкие ГЛФ (растворы, капли, настои, отвары, сиропы, лосьоны и др.) разбавляют стерильным фосфатным буфером также 1:10. Мягкие ГЛФ (мази, пасты, свечи, эмульсии и др.) готовят к испытанию по такой же методике как при испытании на стерильность (см.).
Определение общего микробного числа. При титрационном методе основное разведение разводят в 10 раз фосфатным буфером или 0,5% раствором хлорида натрия с 0,1% желатином. По 1 мл основного (1:10) и дополнительного (1:100) разведений вносят в 2 стерильные чашки, заливают 20 мл расплавленного и остуженного до 48-50оС сахарного МПА. Посевы инкубируют при 30- 35оС 48 часов, после чего подсчитывают число колоний и рассчитывают среднее число колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл (г) цельного испытуемого препарата. Среднее число КОЕ в посеве основного разведения для кожных антибиотиков и антисептиков должно быть не больше 10, для пероральных - не больше 100, в дополнительном разведении - соответственно не больше 1 и 10. У сильных антибиотиков и антисептиков в посеве основного разведения может наблюдаться торможение роста или полное отсутствие роста, вызванное ингибирующим действием остаточной концентрации препарата. В разведении 1:100 такое явление мало вероятно. Тем не менее, в таких случаях лучше использовать метод мембранных фильтров. Испытание ГЛФ на общее содержание в них грибов проводят также способом прямого посева, но на плотную среду Сабуро, которую инкубируют 5 суток при 20-25оС. Определение присутствия в ГЛФ противомикробных препаратов энтеробактерий, стафилококков и синегнойных бактерий проводят способами прямого посева или мембранных фильтров. При способе прямого посева 10 г (мл) образца препарата засевают на 100 мл среды обогащения. Для энтеробактерий такой средой является бульон Хоттингера, для стафилококков и синегнойных бактерий - 5% солевой бульон. Посевы инкубируют 48 часов при 30-35оС, после чего делают пересев со среды Хоттингера на среду Эндо, из одной колбы солевого бульона - на ЖСА (на стафилококки), из другой колбы с солевым бульоном - на среду Кинг А (для выявления пигмента). Идентификация выделенных культур проводится по тем же тестам, как и в других случаях выделения этих бактерий из объектов внешней среды. При отсутствии в посевах 10 г образца препарата энтеробактерий, золотистых стафилококков и синегнойных бактерий делается вывод о пригодности препарата для использования в лечебных и профилактических целях. Метод прямого посева на среды может дать искажённые результаты в случаях, если разведение препарата в 10 раз недостаточно для исключения противомикробного действия препарата. В этих случаях необходимо параллельно ставить контроль на нейтрализацию с типовыми тест-штаммами кишечной палочки, золотистого стафилококка и синегнойных бактерий. Более надёжные результаты даёт испытание методом мембранных фильтров.
