Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


»нфекционный процесс

»нфекционный процесс в восприимчивом организме человека возникает после воздействи€ на него различными факторами патогенности микроорганизмов. Ёто могут быть разнообразные ферменты, токсины, белки, поверхностные вещества, капсула и пр. ќрганизм защищаетс€ и противодействует факторам патогенности и самому микроорганизму своими многочисленными факторами иммунного ответа и общего действи€: например, “-лимфоциты, ¬-лимфоциты, антитела, фагоциты, система комплемента, медиаторы, секреты слизистых, интерферон и пр.

–ассмотрим некоторые из факторов защиты организма человека.

‘агоцитоз - важный клеточный фактор общей резистентности организма. ѕоскольку фагоцит должен осуществл€ть р€д функций дл€ про€влени€ своей фагоцитарной активности, существуют разные методы определени€ фагоцитарной активности и наличи€ хемотаксиса.

Ќаработано несколько способов определени€ активности фагоцитов:

1. ¬ыделенные нейтрофилы соедин€ют на предметном стекле с половинным по объему количеству грибов Candida albicans. «атем фагоциты разрушают дезоксихолатом натри€ (2,5 % раствор) и внос€т 0,01 % раствор метиленовой синей дл€ окраски грибов, потер€вших жизнеспособность. ѕодсчитывают число убитых грибов.

2.  ровь из пальца в количестве 0,1 мл помещают на стерильное покровное стекло и выдерживают во влажной камере 45 мин при 450 —, после чего сгусток удал€ют пинцетом. ѕокровное стекло с прикрепленными к нему нейтрофилами промывают в растворе ’енкса, внос€т к ним расчетную дозу грибов и стекло помещают во влажную камеру, клетками вверх на 30 мин при 450 —. «атем стекло промывают в растворе ’енкса и высушивают. ѕрепарат окрашивают по методу –омановского-√имзе, подсчитывают фагоцитарное число - процент фагоцитов, поглотивших грибы, фагоцитарный индекс - среднее число поглощенных частиц на 1 фагоцит.

3. ќпределение кислородного метаболизма фагоцитов (Ќ—“-тест).  аплю крови из пальца помещают на предметное стекло, инкубируют во влажной камере 60 мин при 370 —. —нимают эритроцитарный слой иглой, обвод€ по периметру и подцепив его. ѕредметное стекло заливают нитросиним тетразолием, инкубируют 20 мин при 370 — и подсушивают. ‘иксируют метанолом и крас€т 2 % раствором метиленовым зеленым 12-15 мин. —читают клетки с гранулами формазана. ¬ активных фагоцитах бесцветный Ќ—“ превращаетс€ в синий нерастворимый формазан.

јктивность системы комплемента. —истема комплемента играет важную роль в реализации воспалительных и иммунных реакций. Ќазвание комплемент Ц дано литической системе ѕ.Ёрлихом (1900).

ћетод определени€ активности комплемента заключаетс€ в определении 50 % гемолиза - наибольшем разведении комплемента, обеспечивающем гемолиз 50 % взвеси эритроцитов.

¬начале создаетс€ гемолитическа€ система: смешивают равные объемы - 5 % взвеси нативных эритроцитов барана и гемолитической сыворотки в трехкратной концентрации (в концентраци€, в три раза выше, чем титр). ¬ыдерживают 30 мин при 370 — и отмывают от свободных антител и других элементов сыворотки. √емсистему (осадок эритроцитов барана, нагруженных антителами гемолитической сыворотки) ресуспендируют до 5 % взвеси.

»сследуемую сыворотку в разведении 1: 10 разливают: в первую пробирку в объеме 0,05 мл, во вторую - 0,1 мл, в третью - 0,15 мл, в четвертую - 0,20 мл, в п€тую - 0,25 мл, в шестую - 0,30 мл, в седьмую - 0,35 мл, в восьмую - 0,40 мл, в дев€тую - 0,45 мл, в дес€тую - 0,50 мл.

¬нос€т в пробирки 0,85 % раствор хлорида натри€ до 1,5 мл в каждую пробирку, т.е. в первую -1,45 мл, во вторую - 1,4 мл и т.д. «атем в каждую из этих пробирок внос€т по 1,5 мл гемолитической системы и инкубируют 45 мин при 370 —. —тепень гемолиза измер€ют на ‘Ё  или делают предварительно 10 пробирок с разной степенью гемолиза равной взвеси эритроцитов: перва€ пробирка - 100 % гемолиз, втора€ - 90 %, треть€ - 80 % и т.д. до 10 % гемолиза. —равнива€ пробирки, определ€ют 50 % гемолиз в опытном р€ду.

Ћизоцим ќдин из факторов общей резистентности организма. ‘ермент, оказывающий бактерицидное действие на кокковую микрофлору. ќпределение активности этого фермента провод€т следующим образом. ¬ 5 пробирок внос€т 0,9 мл 0,85 % раствора хлорида натри€, а затем в первую пробирку внос€т 0,1 мл лизоцима в разведении 1:10, перемешивают, после чего готов€т 10-кратные разведени€, путем переноса 0,1 мл раствора лизоцима из первой пробирки во вторую, после перемешивани€, перенос€т 0,1 мл в третью и т.д. до разведени€ 1: 10000 (четверта€ пробирка). ѕ€та€ пробирка - контроль (не содержит лизоцима). ¬о все пробирки внос€т по 0,5 мл 1 млрд взвеси Micrococcus lisodeiecus или другой микроб. —месь перемешивают и инкубируют в термостате при 370 — в течение 3 ч. ќтмечают наибольшее разведение лизоцима, вызвавшее лизис микробов.

ћетод ћанчини (определение сывороточных иммуноглобулинов). Ќа ровной плоской поверхности (стекл€нна€ пластина, крышка от пластины дл€ иммунологических реакций) создают слой гел€, толщиной 1-2 мм, содержащий антисыворотку к определенному классу »√ человека.

¬ геле штампуют лунки, которые затем заполн€ют испытуемыми сыворотками человека дл€ определени€ количества иммуноглобулинов.

ѕластины оставл€ют на 2-5 дней и учитывают результат. ћолекулы иммуноглобулинов диффундируют в геле во все стороны и в месте оптимальной концентрации образуют кольцо преципитации - как результат реакции с антисывороткой. ƒиаметр кольца преципитации должен соответствовать количественному содержанию »√ в исследуемой сыворотке.

—пециальной линейкой измер€ют наибольший диаметр кольца преципитации, а затем по таблицам определ€ют количество »√ в исследуемой сыворотке. ¬ норме содержание »√ в сыворотке колеблетс€ в пределах: IgM - 0,65-1,65 г/л, IgG - 7,50-15,45 г/л, IgA - 1,25-2,50 г/л.

–“ћЋ Ц реакци€ торможени€ миграции лейкоцитов. –“ћЋ основана на феномене подавлени€ миграции лейкоцитов фактором, который выдел€ют сенсибилизированные лейкоциты при взаимодействии с чужеродным агентом.

—иликонизированные капилл€ры заполн€ют взвесью лейкоцитов крови, ввод€т в них клетки Ђчужакаї, центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об. в мин, затем отламывают конец капилл€ра, не содержащего осадка клеток. Ѕактерии, вирусы и пр. агенты добавл€ют или в суспензию лейкоцитов или в инкубационную камеру.  апилл€ры помещают в камеру с питательной средой 199 и инкубируют при 37о — в течение 18-24 ч. Ћейкоциты мигрируют из капилл€ра и образуют зону помутнени€ в среде. ѕлощадь зоны помутнени€ проецируют на бумагу. ¬ычисл€ют индекс подавлени€ миграции лейкоцитов агентом в сравнении с контрольной миграцией лейкоцитов без агента.

–Ѕ“Ћ Цреакци€ бласттрансформации лимфоцитов. –еакци€ основана на феномене активации лимфоцитов под вли€нием стимула (митогена), с трансформацией их в бласты Ц большие дел€щиес€ клетки. Ётим определ€етс€ пролиферативна€ потенци€ лимфоцитов.

—вежую гепаринизированную кровь человека в количестве 0,6 мл развод€т в 5 раз средой »гла с добавлением 20 мл (в концентрации 80 мкг/мл) глутамина и внос€т по 100 мкл вместе с митогеном в 96-луночные планшеты дл€ иммунологических реакций. ¬ качестве мутагена можно использовать лаконос (PWM) в концентрации 5 мг/мл. ѕланшеты оставл€ют совместно с —ќ2 при 370 — на 72 ч, но за 16 ч до окончани€ инкубации внос€т 5 мкг  и/мл 3Ќ-тимидин. ѕосле завершени€ культивировани€, клетки снимают с помощью харвестра на нитроцеллюлозные фильтры.

”ровень бласттрансформации лимфоцитов оценивают по интенсивности включени€ тимидина с помощью счетчика и жидкостного сцинцил€тора и выражают в импульсах в мин. »ндекс стимул€ции рассчитывают из соотношений показателей митогениндуцированной и спонтанной бласттрансформации лимфоцитов.

÷итотоксический тест лимфоцитов. Ћимфоциты периферической крови способны разрушать in vitro клетки-мишени как сенсибилизированные, та и не сенсибилизированные антителами. Ёто свойство лимфоцитов используют дл€ оценки киллерной активности.

1. ќценка активности  -клеток. ¬ качестве клеток-мишеней в данном тесте примен€ют эритроциты барана.   0,1 мл 0,5 % взвеси нативных эритроцитов барана добавл€ют 0,01 мл суспензии лимфоцитов и инкубируют 3-4 ч при 37о —. ƒалее смесь центрифугируют при 500 об. в мин в течение 10 мин. —упернатант удал€ют. ÷итотоксическую активность определ€ют по выходу гемоглобина из лизированных клеток.   супернатанту добавл€ют 0,2 мл бензидина и 0,2 мл 3 % Ќ2ќ2. ƒалее на спектрофотометре определ€ют оптическую плотность жидкости.

2. ќценка активности естественных киллеров (NK-клеток). ¬ качестве клеток-мишеней берут опухолевые клетки. ¬ €чейки круглодонной пластины помещают 1-2 . 104 меченых клеток-мишеней, к ним добавл€ют лимфоциты Ц 1-1,5 . 106 клеток в мл. —месь инкубируют при 370 — в течение 4-14 ч. јктивность естественных киллеров определ€ют по выделению в надосадок радиоактивного изотопа.

3. ÷итотоксический тест. ћожно установить факт присоединени€ антител к клеткам с помощью определени€ жизнеспособности клеток в цитотоксическом тесте.

¬ лунки панели типа “акачи дл€ микротитровани€ внос€т суспензию клеток, сыворотку к ним и комплемент. »нкубируют смесь при 37о — в течение 40 мин. «атем провод€т окраску клеток трепановым синим, фиксируют их формальдегидом, перенос€т каплю смеси на предметное стекло и с использованием светового микроскопа определ€ют количество клеток, потер€вших жизнеспособность, т.е. окрашенных. ѕо сути Ц это реакци€ пр€мого гемолиза.

ќпределение ÷»  (циркулирующих иммунных комплексов). —ыворотку крови развод€т 0,85 % раствором хлорида натри€ 1:25, смешивают с 7 % взвесью ѕЁ√ (полиэтиленгликол€) 1:1. ѕробирки помещают в холодильник на 18 ч, затем центрифугируют 15 мин при 1500 об в мин, удал€ют супернатант, а осадок раствор€ют в 2,5 мл 0,1 н раствора NaOH, тщательно его перемешивают, оставл€ют при комнатной температуре на 30 мин. ѕробы замер€ют на спектрофотографе с длиной волн 280 нм против 0,1 раствора NaOH. ”ровни ÷»  выражают в ≈ќѕ (единице оптической плотности). ”ровни ÷»  в норме не должны превышать 0,110 ≈ќѕ.

¬торой способ. Ќа культуре клеток линии Raji наход€тс€ рецепторы к —3 компоненту комплемента. ѕри добавлении исследуемой пробы к этим клеткам иммунный комплексы, св€занные с —3 компонентом будут фиксированы на клетках. ќни вы€вл€ютс€ с помощью меченых ферментом кроличьих антител к иммуноглобулинам сыворотки человека (по типу »‘ј).

ќпределение поверхностных —D-антигенов

–еакци€ широко примен€етс€, например, при обследовании ¬»„-инфицированных, в диагностике иммунодефицита и пр. –азработаны разные модификации определени€ CD- антигенов. ¬ основе метода лежит определение специфических маркеров лимфоцитов и других клеток, с помощью моноклональных антител. Ќапример, “-лимфоциты содержат —D3+, “-хелпер (“-индуктор) —D4+, “-киллер и “-супрессор —D8+, ¬-лимфоциты —D19+ и т.д.

ѕримен€ют моноклональные антитела, получаемые при сли€нии миеломных клеток с плазматическими клетками, к одному из маркеров клеток. ѕолученные моноклональные антитела к одному из —D-антигенов, мет€т флюооресцеином, например, изотиоционатом, антитела к другому —D-антигену мет€т фикоэритритом. —мешивают такие моноклональные антитела с лимфоцитами и мазок помещают в люминисцентный микроскоп. ѕод действием света с длиной волны 488 нм первый краситель излучает зеленый цвет, а второй Ц оранжевый цвет. ¬озможно применение нового флюорохрома перидинина, излучающего красный цвет. »спользу€ три флюорохрома возможно одновременное определение трех разных —D-антигенов в люминисцентном микроскопе.



<== предыдуща€ лекци€ | следующа€ лекци€ ==>
Ёкологи€ микроорганизмов | ‘акторы патогенности микроорганизмов
ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-05-07; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 359 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

Ќасто€ща€ ответственность бывает только личной. © ‘азиль »скандер
==> читать все изречени€...

547 - | 474 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.01 с.