Инфекционный процесс в восприимчивом организме человека возникает после воздействия на него различными факторами патогенности микроорганизмов. Это могут быть разнообразные ферменты, токсины, белки, поверхностные вещества, капсула и пр. Организм защищается и противодействует факторам патогенности и самому микроорганизму своими многочисленными факторами иммунного ответа и общего действия: например, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, антитела, фагоциты, система комплемента, медиаторы, секреты слизистых, интерферон и пр.
Рассмотрим некоторые из факторов защиты организма человека.
Фагоцитоз - важный клеточный фактор общей резистентности организма. Поскольку фагоцит должен осуществлять ряд функций для проявления своей фагоцитарной активности, существуют разные методы определения фагоцитарной активности и наличия хемотаксиса.
Наработано несколько способов определения активности фагоцитов:
1. Выделенные нейтрофилы соединяют на предметном стекле с половинным по объему количеству грибов Candida albicans. Затем фагоциты разрушают дезоксихолатом натрия (2,5 % раствор) и вносят 0,01 % раствор метиленовой синей для окраски грибов, потерявших жизнеспособность. Подсчитывают число убитых грибов.
2. Кровь из пальца в количестве 0,1 мл помещают на стерильное покровное стекло и выдерживают во влажной камере 45 мин при 450 С, после чего сгусток удаляют пинцетом. Покровное стекло с прикрепленными к нему нейтрофилами промывают в растворе Хенкса, вносят к ним расчетную дозу грибов и стекло помещают во влажную камеру, клетками вверх на 30 мин при 450 С. Затем стекло промывают в растворе Хенкса и высушивают. Препарат окрашивают по методу Романовского-Гимзе, подсчитывают фагоцитарное число - процент фагоцитов, поглотивших грибы, фагоцитарный индекс - среднее число поглощенных частиц на 1 фагоцит.
3. Определение кислородного метаболизма фагоцитов (НСТ-тест). Каплю крови из пальца помещают на предметное стекло, инкубируют во влажной камере 60 мин при 370 С. Снимают эритроцитарный слой иглой, обводя по периметру и подцепив его. Предметное стекло заливают нитросиним тетразолием, инкубируют 20 мин при 370 С и подсушивают. Фиксируют метанолом и красят 2 % раствором метиленовым зеленым 12-15 мин. Считают клетки с гранулами формазана. В активных фагоцитах бесцветный НСТ превращается в синий нерастворимый формазан.
Активность системы комплемента. Система комплемента играет важную роль в реализации воспалительных и иммунных реакций. Название комплемент – дано литической системе П.Эрлихом (1900).
Метод определения активности комплемента заключается в определении 50 % гемолиза - наибольшем разведении комплемента, обеспечивающем гемолиз 50 % взвеси эритроцитов.
Вначале создается гемолитическая система: смешивают равные объемы - 5 % взвеси нативных эритроцитов барана и гемолитической сыворотки в трехкратной концентрации (в концентрация, в три раза выше, чем титр). Выдерживают 30 мин при 370 С и отмывают от свободных антител и других элементов сыворотки. Гемсистему (осадок эритроцитов барана, нагруженных антителами гемолитической сыворотки) ресуспендируют до 5 % взвеси.
Исследуемую сыворотку в разведении 1: 10 разливают: в первую пробирку в объеме 0,05 мл, во вторую - 0,1 мл, в третью - 0,15 мл, в четвертую - 0,20 мл, в пятую - 0,25 мл, в шестую - 0,30 мл, в седьмую - 0,35 мл, в восьмую - 0,40 мл, в девятую - 0,45 мл, в десятую - 0,50 мл.
Вносят в пробирки 0,85 % раствор хлорида натрия до 1,5 мл в каждую пробирку, т.е. в первую -1,45 мл, во вторую - 1,4 мл и т.д. Затем в каждую из этих пробирок вносят по 1,5 мл гемолитической системы и инкубируют 45 мин при 370 С. Степень гемолиза измеряют на ФЭК или делают предварительно 10 пробирок с разной степенью гемолиза равной взвеси эритроцитов: первая пробирка - 100 % гемолиз, вторая - 90 %, третья - 80 % и т.д. до 10 % гемолиза. Сравнивая пробирки, определяют 50 % гемолиз в опытном ряду.
Лизоцим Один из факторов общей резистентности организма. Фермент, оказывающий бактерицидное действие на кокковую микрофлору. Определение активности этого фермента проводят следующим образом. В 5 пробирок вносят 0,9 мл 0,85 % раствора хлорида натрия, а затем в первую пробирку вносят 0,1 мл лизоцима в разведении 1:10, перемешивают, после чего готовят 10-кратные разведения, путем переноса 0,1 мл раствора лизоцима из первой пробирки во вторую, после перемешивания, переносят 0,1 мл в третью и т.д. до разведения 1: 10000 (четвертая пробирка). Пятая пробирка - контроль (не содержит лизоцима). Во все пробирки вносят по 0,5 мл 1 млрд взвеси Micrococcus lisodeiecus или другой микроб. Смесь перемешивают и инкубируют в термостате при 370 С в течение 3 ч. Отмечают наибольшее разведение лизоцима, вызвавшее лизис микробов.
Метод Манчини (определение сывороточных иммуноглобулинов). На ровной плоской поверхности (стеклянная пластина, крышка от пластины для иммунологических реакций) создают слой геля, толщиной 1-2 мм, содержащий антисыворотку к определенному классу ИГ человека.
В геле штампуют лунки, которые затем заполняют испытуемыми сыворотками человека для определения количества иммуноглобулинов.
Пластины оставляют на 2-5 дней и учитывают результат. Молекулы иммуноглобулинов диффундируют в геле во все стороны и в месте оптимальной концентрации образуют кольцо преципитации - как результат реакции с антисывороткой. Диаметр кольца преципитации должен соответствовать количественному содержанию ИГ в исследуемой сыворотке.
Специальной линейкой измеряют наибольший диаметр кольца преципитации, а затем по таблицам определяют количество ИГ в исследуемой сыворотке. В норме содержание ИГ в сыворотке колеблется в пределах: IgM - 0,65-1,65 г/л, IgG - 7,50-15,45 г/л, IgA - 1,25-2,50 г/л.
РТМЛ – реакция торможения миграции лейкоцитов. РТМЛ основана на феномене подавления миграции лейкоцитов фактором, который выделяют сенсибилизированные лейкоциты при взаимодействии с чужеродным агентом.
Силиконизированные капилляры заполняют взвесью лейкоцитов крови, вводят в них клетки «чужака», центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об. в мин, затем отламывают конец капилляра, не содержащего осадка клеток. Бактерии, вирусы и пр. агенты добавляют или в суспензию лейкоцитов или в инкубационную камеру. Капилляры помещают в камеру с питательной средой 199 и инкубируют при 37о С в течение 18-24 ч. Лейкоциты мигрируют из капилляра и образуют зону помутнения в среде. Площадь зоны помутнения проецируют на бумагу. Вычисляют индекс подавления миграции лейкоцитов агентом в сравнении с контрольной миграцией лейкоцитов без агента.
РБТЛ –реакция бласттрансформации лимфоцитов. Реакция основана на феномене активации лимфоцитов под влиянием стимула (митогена), с трансформацией их в бласты – большие делящиеся клетки. Этим определяется пролиферативная потенция лимфоцитов.
Свежую гепаринизированную кровь человека в количестве 0,6 мл разводят в 5 раз средой Игла с добавлением 20 мл (в концентрации 80 мкг/мл) глутамина и вносят по 100 мкл вместе с митогеном в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций. В качестве мутагена можно использовать лаконос (PWM) в концентрации 5 мг/мл. Планшеты оставляют совместно с СО2 при 370 С на 72 ч, но за 16 ч до окончания инкубации вносят 5 мкг Ки/мл 3Н-тимидин. После завершения культивирования, клетки снимают с помощью харвестра на нитроцеллюлозные фильтры.
Уровень бласттрансформации лимфоцитов оценивают по интенсивности включения тимидина с помощью счетчика и жидкостного сцинцилятора и выражают в импульсах в мин. Индекс стимуляции рассчитывают из соотношений показателей митогениндуцированной и спонтанной бласттрансформации лимфоцитов.
Цитотоксический тест лимфоцитов. Лимфоциты периферической крови способны разрушать in vitro клетки-мишени как сенсибилизированные, та и не сенсибилизированные антителами. Это свойство лимфоцитов используют для оценки киллерной активности.
1. Оценка активности К-клеток. В качестве клеток-мишеней в данном тесте применяют эритроциты барана. К 0,1 мл 0,5 % взвеси нативных эритроцитов барана добавляют 0,01 мл суспензии лимфоцитов и инкубируют 3-4 ч при 37о С. Далее смесь центрифугируют при 500 об. в мин в течение 10 мин. Супернатант удаляют. Цитотоксическую активность определяют по выходу гемоглобина из лизированных клеток. К супернатанту добавляют 0,2 мл бензидина и 0,2 мл 3 % Н2О2. Далее на спектрофотометре определяют оптическую плотность жидкости.
2. Оценка активности естественных киллеров (NK-клеток). В качестве клеток-мишеней берут опухолевые клетки. В ячейки круглодонной пластины помещают 1-2 . 104 меченых клеток-мишеней, к ним добавляют лимфоциты – 1-1,5 . 106 клеток в мл. Смесь инкубируют при 370 С в течение 4-14 ч. Активность естественных киллеров определяют по выделению в надосадок радиоактивного изотопа.
3. Цитотоксический тест. Можно установить факт присоединения антител к клеткам с помощью определения жизнеспособности клеток в цитотоксическом тесте.
В лунки панели типа Такачи для микротитрования вносят суспензию клеток, сыворотку к ним и комплемент. Инкубируют смесь при 37о С в течение 40 мин. Затем проводят окраску клеток трепановым синим, фиксируют их формальдегидом, переносят каплю смеси на предметное стекло и с использованием светового микроскопа определяют количество клеток, потерявших жизнеспособность, т.е. окрашенных. По сути – это реакция прямого гемолиза.
Определение ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов). Сыворотку крови разводят 0,85 % раствором хлорида натрия 1:25, смешивают с 7 % взвесью ПЭГ (полиэтиленгликоля) 1:1. Пробирки помещают в холодильник на 18 ч, затем центрифугируют 15 мин при 1500 об в мин, удаляют супернатант, а осадок растворяют в 2,5 мл 0,1 н раствора NaOH, тщательно его перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Пробы замеряют на спектрофотографе с длиной волн 280 нм против 0,1 раствора NaOH. Уровни ЦИК выражают в ЕОП (единице оптической плотности). Уровни ЦИК в норме не должны превышать 0,110 ЕОП.
Второй способ. На культуре клеток линии Raji находятся рецепторы к С3 компоненту комплемента. При добавлении исследуемой пробы к этим клеткам иммунный комплексы, связанные с С3 компонентом будут фиксированы на клетках. Они выявляются с помощью меченых ферментом кроличьих антител к иммуноглобулинам сыворотки человека (по типу ИФА).
Определение поверхностных СD-антигенов
Реакция широко применяется, например, при обследовании ВИЧ-инфицированных, в диагностике иммунодефицита и пр. Разработаны разные модификации определения CD- антигенов. В основе метода лежит определение специфических маркеров лимфоцитов и других клеток, с помощью моноклональных антител. Например, Т-лимфоциты содержат СD3+, Т-хелпер (Т-индуктор) СD4+, Т-киллер и Т-супрессор СD8+, В-лимфоциты СD19+ и т.д.
Применяют моноклональные антитела, получаемые при слиянии миеломных клеток с плазматическими клетками, к одному из маркеров клеток. Полученные моноклональные антитела к одному из СD-антигенов, метят флюооресцеином, например, изотиоционатом, антитела к другому СD-антигену метят фикоэритритом. Смешивают такие моноклональные антитела с лимфоцитами и мазок помещают в люминисцентный микроскоп. Под действием света с длиной волны 488 нм первый краситель излучает зеленый цвет, а второй – оранжевый цвет. Возможно применение нового флюорохрома перидинина, излучающего красный цвет. Используя три флюорохрома возможно одновременное определение трех разных СD-антигенов в люминисцентном микроскопе.
