Основными факторами патогенности являются многочисленные токсины и ферменты. Приводим некоторые методы определения этих патогенных факторов.
Токсины. Это активные в биологическом, антигенном, токсигенном и др. действиях факторы патогенности многих микроорганизмов. Токсины (греч. toxicon - яд) бывают двух типов: экзогенные (собственно токсины) и эндогенные.
1. Определение летального токсина.
а) Культуру, например, стафилококка штамма Кован засевают на чашку Петри с агаром, приготовленным по методу Париш и Кларка (агар, разведенный мартеновским бульоном поровну). Чашки помещают в эксикатор (с 20 % содержанием СО2), далее - в термостат на 24 ч при 370 С. После инкубации наливают еще 10 мл мартеновского бульона и выдерживают еще сутки. Затем содержимое чашки фильтруют через марлю, потом свечи Шамберлана или фильтр Зейтца.
б). Определяют летальность токсина, вводя его лабораторным животным (кролики и пр.) внутривенно по 0,1-0,5 мл фильтрата в разных разведениях стерильной дистиллированной водой. Определяют DLV50 (дозу летальности 50 %), когда от определенной дозы токсина гибнет 50 % опытных животных.
2. Определение токсигенных свойств C.diphtheriae.
Расплавляют агар Мартена при 90о С в водной бане.
Охлаждают до 500 С и добавляют 20 % сыворотки крови КРС. Смесь перемешивают и выливают в чашку Петри, давая ей равномерно растекаться по дну чашки. В центр чашки на застывающий агар обожженным пинцетом накладывают бумагу фильтровальную, заранее пропитанную сывороткой антитоксической противодифтерийной.
Подсушивают чашку в термостате 15-20 мин, затем переворачивают вверх дном
Затем на чашку засевают культуру в виде бляшек, диаметром 0,6-0,7 см, на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку наносят не более 10 бляшек разных культур, из них 4- контрольные, три - tox+ и одна - tox- культуры.
После экспозиции 2-4 суток, наблюдают следующие виды результатов:
1. Испытуемые культуры являются токсигенными, если их линии преципитации могут сливаться с другими культурами положительными и контролем (+).
2. Используемые культуры нетоксигенные, если линии их преципитации не сливаются с линиями, образованными положительными культурами и (+) контролями, они могут даже перекрещиваться с линиями специфическими.
3. Некротические свойства токсина. Делают разведения фильтрата от 1:20 до 1:10240 на дистиллированной воде.
Вводят кролику по 0,2 мл фильтрата. Токсин средней силы при этой пробе вызывает образование некроза в разведении 1:1200 через 24-48 ч.
Мышам вводят по 0,1 мл столбнячного токсина. Через 24-48 ч появляются признаки поражения центральной нервной системы, выражающиеся в спастических сокращениях отдельных мышечных групп, а затем гибели мышей от паралича дыхательных мышц.
4. Определение гемолитической активности токсина. Готовят ряд последовательных разведений токсина на 0,85 % растворе хлорида натрия, начиная с 1:10 и далее до 1: 10000. К 1 мл каждого разведения токсина добавляют по 1 мл 20 % взвеси нативных эритроцитов кролика, отмытых трижды изотоническим раствором хлорида натрия. В отдельную пробирку вместо токсина вводят растворитель. Пробирки ставят на 2 ч в термостат, затем на 2 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результат. Полный лизис ++++, лизис почти полный +++, не полный лизис и значительный осадок на дне ++, лизис отсутствует (-).
Ферменты
1. Определение каталазы. На предметное стекло наносят 2 капли 3 % раствора перекиси водорода. В первую каплю платиновой петлей вносят культуру S.aureus и равномерно ее растирают круговыми движениями петли. После этого петлю прожигают и во вторую каплю вносят таким же образом культуру S.pyogenes. При наличие фермента каталазы - происходит расщепление перекиси водорода, что сопровождается выделением пузырьков газа (культура стафилококка). При отрицательной реакции расщепления перекиси водорода не последует - будут отсутствовать пузырьки газа (стрептококк - каталаза отрицательный).
2. Определение гиалуронидазы. В пробирку с культурой испытуемых бактерий вносят по 0,5 мл гиалуроновой кислоты и после экспозиции при 370 С в течение 30 мин добавляют 2 капли 2 n раствора уксусной кислоты. Параллельно делают контроль без микробной взвеси. В контроле выпадает слизистый комочек. В опыте этого не происходит
3. Определение коагулазы. Свежую плазму крови разводят в 5 раз стерильным 0,85 % раствором хлорида натрия и разливают по 0,5 мл по стерильным пробиркам. В пробирку вносят 1 петлю агаровой суточной культуры исследуемого штамма и суспендируют в плазме. Во вторую пробирку вносят заведомо коагулазо (+) штамм и в третью пробирку - коагулазо (-) штамм и еще оставляют пробирку с незасеянной плазмой. Штатив помещают в термостат при 370 С и регистрируют результат через 1, 2, 4, 18 ч инкубации.
Появление на дне 1-ой и 2-ой пробирок студнеобразного сгустка любого размера – есть положительный результат. Отсутствие свертывания плазмы через 18 ч можно расценивать как отрицательный результат.
4. Определение ДНКазы. К 100 мл расплавленного 1,8 % мясо-пептонного агара рН 8,6 добавляют раствор ДНК (50 мг, 100 мг или 200 мг высокополимерной ДНК растворяют в 3-5 мл дистиллированной воды, подщелоченной 4-5 каплями 2 М раствора NaOH) и прогревают среду 20 мин в кипящей водяной бане. Затем в слегка охлажденный агар вносят раствор 10 % стерильного CaCO2 (0,5 мл), перемешивают и разливают тонким слоем в чашки Петри.
Суточную агаровую культуру исследуемого штамма засевают короткими штрихами на поверхность подсушенного агара. На одну чашку можно засеять до 16 штаммов. После 18-24 ч инкубации при 370 С поверхность агара заливают 5-8 мл 3 М раствора HCl. Через 2 мин кислоту сливают и регистрируют результат.
Появление вокруг культуры непрозрачной зоны (деполимеризация ДНК), которая в 4 раза превосходит по ширине зону микробного роста (2-3 мл зона роста) свидетельствует о положительной реакции на ДНКазу. Меньшая доза деполимеризации должна расцениваться как сомнительный результат.
5. Определение фосфатазы. Фенолфталеинфосфат натрия добавляют в концентрации 0,01 % к 100 мл расплавленного и охлажденного 1,8 % питательного агара, перемешивают и разливают в чашки Петри. Суточные агаровые культуры исследуемых штаммов засевают на чашку с помощью петли. Инкубируют в течение 18-24 ч при 370 С. После инкубации на крышку чашки Петри наливают 5-6 капель 25 % раствора аммиака, выдерживают чашку в перевернутом виде на крышке 5-10 мин, подвергая культуру действию паров аммиака и регистрируют результат. О положительной реакции свидетельствует розовое окрашивание микроколоний.
6. Определение гемолизина. В чашки с кровяным агаром засевают методом бляшек исследуемую культуру бактерий. В эту же чашку засевают культуры заведомо tox+ и tox - контроли.Чашку инкубируют в термостате при 370 С в течение 18-24 ч. Затем проводят учет реакции, начиная с контролей. Наличие гемолизина у исследуемой культуры регистрируют по появлению вокруг бляшек зоны гемолиза - просветление кровяной среды.
Факторы адгезии Наличие у бактерий пилей - факторов адгезии выявляется в маннозочувствительных и маннозорезистентных реакциях гемагглютинации. В планшеты для микротитрования вносят 4 % взвесь отмытых эритроцитов человека, 1 % раствор D-маннозы и суспензию испытуемых бактерий в концентрации 109 клеток в 1 мл. Каждый компонент добавляют в дозе 0,05 мл
Реакцию гемагглютинации учитывают как положительную, если в течение 30-60 мин происходит склеивание эритроцитов человека. Они оседают на дно лунок в виде широкого осадка, условно обозначаемого как «зонтик». Отрицательная реакция проявляется оседанием эритроцитов в виде маленькой «точки» или «колечка».
