Микробиологическая диагностика.

Дифтерийная палочка – возбудители дифтерии.

Дифтерия – острое инфекционное заболевание, характеризующееся токсическим поражением сердечно-сосудистой и нервной систем, а также специфическим фибринозным (дифтеритическим) воспалением в месте входных ворот.

Возбудитель был открыт в 1883 г. Клебсом, в 1884 г. Ф. Леффлер выделил его в чистой культуре. В 1888 г. Ру и Йерсен получили дифтерийный токсин, а в 1895 г. Беринг и Ру независимо друг от друга получили противодифтерийную сыворотку. В 1923 г. Рамон разработали технологию получения дифтерийного анатоксина, а позднее получил противодифтерийную сыворотку. Н.Г. Габричевский применил противодифтерийную сыворотку с лечебной целью и организовал ее производство в России.

Таксономия.

Род – Corynebacterium

Вид – С. diphtheriae

В род Corynebacterium входят около 60 видов. Согласно Международной классификации Берджи этот род разделен на 3 секции:

1) патогенные для человека и животных;

2) патогенные для растений;

3) непатогенные.

Морфология.

Прямые или слегка изогнутые палочки размером 0,3 - 0,6 х 4 - 8 мкм, спор не образуют, имеют микрокапсулу, неподвижны.

Особенностями дифтерийной палочки является наличие булавовидных утолщениях на концах; палочки отличаются также полиморфизмом; характерно взаимного расположения бактерий в мазках – в виде цифр V,X, L (не полное расхождение при делении);

В толстых мазках располагаются в виде «пучка булавок». Булавовидные утолщения на концах связаны с наличием зерен волютина (тельца Бабеша-Эрнста) – производные нуклеиновых кислот, метахроматиновые гранулы полиметафосфата. Бактерии могут образовывать фильтрующиеся и L-формы.

Грамположительные микроорганизмы. При окраске по методу Нейссера тело клетки окрашивается в синий цвет, а зерна волютина - в желтый. Метод Леффлера окрашивает цитоплазму в голубой цвет, а зерна волютина – в темно-синий.

Культуральные свойства.

Возбудители дифтерии - факультативные анаэробы, отимальная температура их культивирования 37^оС, рН 7,3-8,0. Требовательны к питательной среде, для роста необходимо наличие цистина, гистидина, фенилаланина, метионина и т.д. Факторами роста являются Са²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺. Для культивирования применяют сывороточные (среда Леффлера), среды с добавлением крови, хинозальную среду Бучина. Дифференциально-диагностические среды: теллуритовая среда (Конради, Трох, 1913г.), глицериновокровяная среда с теллуритом (среда Клауберг ΙΙ), сывороточно-теллуритовый агар с цистином (Тиндаль), теллурит-шоколадный агар Маклеода.

На среде Леффлера бактерии растут в виде серовато-кремовых колоний, по типу «шагреневой кожи».

На теллуритовых средах возбудитель образует серовато-черные колонии, что обусловлено восстановлением теллурита до металлического теллура, имеющего черный цвет и аккумулирующегося бактериями.

 

Биохимическая активность.

Дифтерийные палочки малоактивны, сбраживают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин, не разлагают сахарозу, лактозу, маннит, восстанавливают нитраты в нитриты. Не гидролизуют мочевину (проба Закса отрицательная), не образуют индол. Разлагают цистеин (проба Пизу положительная).

По культуральным, биохимическим, патогенетическим и некоторым другим свойствам дифтерийные палочки разделяются на 3 биовара.

 

1) биовар митис, характеризуется свойствами:

• ферментирует глюкозу, крахмал, мальтозу, не сбраживает сахарозу, гликоген, декстрин;
• обладает цистиназной активностью;
• восстанавливает нитраты;
• уреазная проба отрицательная;
• на средах с теллуритом образует мелкие гладкие блестящие черные колонии с ровным краем;
• на жидкой среде дает равномерное помутнение и порошкообразный осадок;
• дает зоны гемолиза на кровяных средах;
• малотоксичен;
• возбудители вызывают легкую спорадическую заболеваемость.

 

2) биовар гравис, характеризуется свойствами:

• ферментирует глюкозу, крахмал,декстрин, мальтозу,
• обладает цистиназной активностью;
• восстанавливает нитраты;
• уреазная проба отрицательная;
• на средах с теллуритом формирует крупные, сухие, матовые, плоские, серо-черные колонии, приподнятые в центре, с радиальной исчерченностью и неровным краем (напоминают маргаритку);
• на жидкой среде образуется пленка, помутнение, крошковидный или крупнозернистый осадок;
• дает гемолиз на кровяных средах;

· обладает выраженными токсигенными свойствами;

· выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии, вызывает групповые вспышки.

 

3) биовар интермедиус, характеризуется свойствами:

· на средах с теллуритом образует мелкие сухие матовые серо-черные колонии с прозрачной периферией и неровным краем;

· на жидкой среде дает помутнение с последующим просветлением и образованием мелкозернистого осадка;

· гемолиз на кровяных средах отсутствует.

Антигенная структура.

Дифтерийная палочка имеет 2 антигена

1. О – антиген (групповой), полисахарид клеточной стенки, термостабильный, дает перекрестные реакции с микобактериями и нокардиями;

2. К – антиген (типовой), капсульный, термолабильный, иммуногенный, видоспецифичный.

На практике серотипирование не применяется, однако выпускаются диагностические сыворотки для РА, РПГА.

Для идентификации используют фаготипирование (22 фага) и бактериоцинотипирование (25 бактериоцинов).

Факторы патогенности.

Токсины. Палочка выделяет токсин – дифтерийный экзотоксин. По силе он занимает 3-е место после ботулинического и столбнячного. Термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный, протективный, обладает анестезирующим действием. Гистотоксин обладает дермонекротическими, гемолитическими свойствами. Синтезируется в виде неактивного предшественника - единой полипептидной цепи с молекулярной массой 61 кД. Активируется под действием собственной протеазы, которая разрезает полипептид на 2 связанные между собой дисульфидными связями пептида: А (21 кД) и В (39 кД). Пептид В выполняет акцепторную функцию – распознает рецептор, связывается с ним, формирует внутримембранный канал, через который проникает в клетку пептид А. Пептид А – это фермент, который обеспечивает перенос аденозиндифосфатрибозы из НАД на один из аминокислотных остатков (гистидина) белкового фактора элонгации EF-2. В результате модификации EF-2 утрачивает свою активность, что приводит к подавлению синтеза белка рибосомами на стадии транслокации. Токсин синтезируют только С. diphtheriae, лизогенные умеренным конвертирующим tox-профагом, интегрирующимся с помощью сайт-специфической рекомбинации. Оперон, кодирующий синтез токсина имеет промотор tox Р и 3 участка: tox S, tox А, tox В. Тox S – обеспечивает выход токсина через мембрану в периплазматическое пространство бактериальной клетки. Утрата клеткой профага или мутации в tox-опероне делают клетку малотоксичной.

Ферменты патогенности: гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин, каталаза – факторы инвазии, лейкоцидин – обеспечивает устойчивость к фагоцитозу;

Структурные и химические компоненты клетки – пили (способствуют адгезии на чувствительных клетках), микрокапсула (обеспечивает устойчивость к фагоцитозу), корд-фактор (6-6-дифосфоэфир трегалозы, коринемиколовая и коринемиколиновая кислоты, обладающие нарушает фосфорилирование в митохондриях), бактериоцины (корицины) кодирование синтеза которых передается плазмидами.

Резистентность.

При нагревании до 60^оС палочки погибают за 10 мин, при 100^оС наступает мгновенная гибель. 5% раствор карболовой кислоты обеспечивает инактивацию через – 1 мин. Под действием прямого солнечного света палочка выживает несколько часов, в высохших пленках и кале – 3-4 мес., на предметах обихода и одежде сохраняется до 15 дней, на мягких игрушках – 3 мес., в воде и молоке – до 20 дней, в пыли – до 5 мес. Дифтерийные палочки чувствительны к пенициллину, тетрациклину, эритромицину.

Эпидемиология.

Источник инфекции – больной человек, носитель или реконвалесцент.

Механизмы передачи инфекции:

– аэрогенный (пути - воздушно-капельный и воздушно-пылевой);

– контактный (путь - непрямой контактный).

Больной опасен (в смысле заражения) с последних дней инкубационного периода.

Входные ворота – слизистые оболочки носа, зева, гортани, трахеи, бронхов, конъюнктивы глаз, наружных половых органов; раневая поверхность, пупочная рана.

Инкубационный период – 2-14-20 дней.

Патогенез.

Возбудители адсорбируются на чувствительных клетках, колонизируют эпителий. Секретируют гистотоксин, который инициирует развитие местного фибринозного воспаления, некроз эпителия, паретическое расширение сосудов с нарушением их проницаемости, отек тканей и выход фибриногена из сосудов. Фибриноген под влиянием тканевого тромбопластина, некротизированных тканей и атмосферным кислородом свертывается. На поверхности образуется фибринозная пленка. На многослойном плоском эпителии - плотная, спаянная с прилежащими тканями; на однослойном – тонкая, легко снимается. Разрастание пленок в воздухоносных путях может привести к асфиксии (истинный круп). Процесс сопровождают регионарные лимфадениты. Системное действие токсина приводит к гемодинамическим нарушениям. Развивается токсический миокардит и ранний паралич сердца. Возможно поражение канальцевого аппарата почек, некроз коркового слоя. В нервной системе – цитолиз нервных клеток с развитием поздних параличей мягкого неба, диафрагмы, сердца, блуждающего нерва. Смерть при дифтерии может наступить от раннего или позднего паралича сердца и диафрагмы, а также в результате истинного крупа (закупорки дыхательных путей оторвавшимися пленками).

У детей грудного возраста чаще развивается дифтерия зева (насмокр, слабая выраженность общих проявлений). Необходимо осматривать пупочную ранку для исключения местного процесса.

 

Иммунитет.

После перенесенного заболевания развивается стойкий напряженный антитоксический и мало выраженный антимикробный иммунитет. Возможно развитие носительства (10%) и повторное заражение (6-8%). Уровень иммунитета можно установить в РПГА. Диагностические – титры - 1:200 и выше. С той же целью применяется реакция Шика – внутрикожное введение микродоз дифтерийного токсина (1/40 Dlm 0,2 мл) внутрикожно. Через 48 ч появляется покраснение и инфильтрат, что свидетельствует об отсутствии антитоксических антител; при их наличии реакция не возникает. Из-за опасности сенсибилизации организма эту пробу проводят редко.

Микробиологическая диагностика.

Исследуемый материал – слизь из зева, носа, пленки с миндалин, раневое отделяемое, кровь

1. Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из исследуемого материала (окраска по Граму, Нейссеру, Леффлеру).

2. Бактериологический метод – выделение чистой культуры возбудителя и ее идентификация. Необходимо не только выделить из исследуемого материала дифтерийную палочку, но и определить ее токсигенность.

Определение токсигенности С. dphtheriae:

а) биологическая проба на животных – внутрикожное заражение морских свинок фильтратом культуры дифтерийных бактерий – вызывает некроз в месте введения. Минимальная смертельная доза (20-30 нг) убивает морскую свинку на 4-5 день;

б) заражение куриных эмбрионов (наблюдается гибель под действием токсина);

в) внесение в культуру клеток (выявление ЦПД);

г) метод твердофазного ИФА с меченными пероксидазой антителами;

д) использование ДНК-зонда для обнаружения tox-оперона в геноме;

е) тест Илека и Оухтерлони (1948 г.) – основу составляет способность токсина и антитоксина диффундировать в агар и образовывать преципитаты (усы, стрелы) по ходу диффузии – метод двойной преципитации в геле, предварительный ответ может быть выдан через 48 часов, через 72 часа – заключение о наличии токсигенных коринебактерий, через 96 часов – окончательный ответ.

3. Серодиагностика – РПГА, ИФА, РИА, реакция ко-агглютинации, реакция Шика.

4. Экспресс – диагностика – РИФ, ИФА, РПГА, реакция ко-агглютинации.

5. Биохимический и молекулярно-биологический метод – ПЦР (обнаружение tox-гена).