Характеристика цитологических методов исследования

Название	Цель	Принцип
Витальная микроскопия
Микроскопия фиксированных клеток
Цитофотометрия
Фракционное центрифугирование
Авторадиография
Культура клеток
Гибридизация соматических клеток
Электронная микроскопия

 

Работа № 2. Изучить устройство светового микроскопа.

I.Механическая система: – – – – – – – II.Оптическая система: – – III.Осветительная система: – –

 

Работа № 3. Правила работы со световыми оптическими приборами.

1) Микроскоп следует правой рукой брать за штатив, а левой – поддерживать основание.

2) Установите микроскоп. Тубусодеожатель должен быть обращен к вам, а зеркало – напротив света.

3) Поставьте объектив малого увеличения в рабочее положение, если действие выполнено правильно, то вы услышите легкий щелчок.

4) Запомните: изучение любого объекта начинается с малого увеличения.

5) Смотрите в окуляр и вращайте зеркало до тех пор, пока поле зрения не будет освещено ярко и равномерно.

6) Опустите объектив малого увеличения (х8) над столиком на высоту примерно 0,5см с помощью макрометрического винта (винт нужно вращать на себя).

7) Положите на предметный столик микропрепарат покровным стеклом вверх так, чтобы объект находился в центре отверстия предметного столика.

8) Смотрите на микроскоп сбоку и опускайте тубус с помощью винта на расстояние приблизительно 2 мм от объектива до препарата.

9) Смотрите в окуляр и медленно поднимайте тубус (вращайте винт на себя) до тех пор, пока не увидите четкого изображения объекта.

10) Перейдите к рассматриванию объекта при большом увеличении. Вращая револьвер, установите объектив большого увеличения (х40) над предметным столиком; дождитесь легкого щелчка; найдите фокус, вращая винтом. Запомните: большое увеличение позволяет видеть глубину объекта, поэтому резко видны то одни, то другие структуры. Фокусное расстояние при большом увеличении составляет приблизительно 1 мм.

11) По окончании работы приведите микроскоп в нерабочее состояние: объективы переведите в нейтральное положение (они не должны смотреть в отверстие в предметном столике); тубус опустите вниз до предела.

3.1. Записать виды объективов и общее разрешение.

Увеличение Объектива	Окуляр (кратность увеличения)	Объектив (кратность увеличения)	Разрешающая возможность
Малое
Большое
Иммерсионное

3.2. Работа с постоянными препаратами.

Разобрать методику приготовления постоянных препаратов. Рассмотреть постоянные препараты биологических объектов (тотальные и срезы).

1) Рассмотреть постоянный препарат (например, препарат клеток печени аксолотля) с помощью микроскопа при ув. 7х8 и 7х40. Отработать навык перехода с микроскопии объекта при малом увеличении на микроскопию объекта при большом увеличении. Зарисовать, отметить все видимые элементы: ядро, границы между клетками, цитоплазму.

2) Иммерсионная микроскопия (ув.7х90) микропрепарата клеток печени аксолотля (демонстрация). Уяснить назначение и принцип иммерсионной микроскопии.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

для студентов 1 курса педиатрического факультета к занятию № 1.1.2. по теме: «Биология клетки. Эукариоты и прокариоты. Цитохимия»

Цель занятия: Рассмотреть строение прокариот и эукариот. Изучить органоиды животной и растительной клетки. Познакомиться с некоторыми основными цитохимическими реакциями.

В итоге занятия студент должен знать: Основные различия между прокариотичес-кой и эукариотической клеткой, животной и растительной клетками, строение и функции органоидов эукариотической клетки и способы их выявления цитохимическими методами.

В итоге занятия студент должен уметь: Самостоятельно получить изображение на малом и большом увеличении, идентифицировать ядро, границы клеток, окрашенные органоиды и клеточные включения.

 

Вопросы для самоподготовки:

1. Химический состав клетки.

2. Что такое органоиды?

3. Какие структуры лежат в основе строения органоидов клетки?

4. Классификация органоидов.

5. Особенности строения прокариотической клетки.

6. Как и в виде чего расположена наследственная информация прокариот?

7. Какие органоиды имеются у эукариот?

8. Функции ядра, ядрышек.

9.Сходства и различия в строении животной и растительной клетки.

Литература для подготовки:

Основная: Учебник по биологии. Под ред. В.Н. Ярыгина, 2008, 1 т, c.38-51.

Рекомендуемая:

1. Учебник по биологии. Под ред. В.Н. Ярыгина, 1984, с. 17-26

2. Учебник по биологии А.А. Слюсарева, с. 14-27.

 

Практическая работа:

Работа № 1. Строение прокариотических клеток на примере бактерий (таблица). Изучить по таблице особенности строения прокариот и записать в тетрадь эти особенности.

Работа № 2. Общий план строения эукариотических клеток растений и животных.

а) клетки растений

Рассмотреть при малом и большом увеличении препарат клеток пленки лука, отметить различия в строении про- и эукариот. Зарисоватьи отметить ядро, клеточную стенку, цитоплазму, вакуоли.

б) клетки животных

Рассмотреть постоянный препарат «срез печени аксолотля» при малом и большом увеличении, зарисовать, отметить все видимые элементы: ядро, границы между клетками, цитоплазму. Отметить в тетради различие в строении растительной и животной клетки.

Работа № 3. Изучение внутреннего строения эукариотической животной клетки.

Работа с электроннограммами. Рассмотреть строение плазматической мембраны, лизосом, ядра, митохондрий, комплекса Гольджи, эндоплазматической сети, клеточного центра, рибосом.

Работа № 4. Выявление ДНК в ядрах клетки по Фельгену.

Под иммерсионным увеличением микроскопа рассмотреть (демонстрация) микропрепараты клеток, окрашенные реактивом Шиффа, фуксин-сернистой кислотой по Фельгену. Зарисовать одну клетку. Отметить, что ДНК в ядре клеток окрашивается по Фельгену в сиренево-фиолетовый цвет. Обратить внимание на глыбчато-нитчатую структуру хроматина в ядрах клеток.

Работа № 5. Выявление РНК по Браше.

Рассмотреть при иммерсионном увеличении микроскопа (демонстрация) микропрепараты, окрашенные на РНК по Браше, полученные из печени крыс. Зарисовать одну клетку с реакцией на РНК. Указать, что РНК по Браше выявляется в виде гранул и глыбок и окрашивается пиронином в малиново-красный цвет. Одновременно метод Браше позволяет компонентам красителя – метиловым-зеленым окрашивать ДНК в зеленый цвет.

Работа № 6. Выявление гликогена.

Рассмотреть на большом увеличении микроскопа микропрепараты, окрашенные на гликоген Шик реакцией, полученные из печени крыс. Зарисоватьи указать, что гликоген окрашивается в темно-вишневый цвет реакцией с Шифф-йодной кислотой (смесь реактива Шиффа с йодной кислотой). ШИК-реакция и выявляется в виде гранул и глыбок, которые часто смещаются при фиксации ткани к одному из полюсов клетки.

Работа № 7. Выявление липидов в клетках.

Изучить на большом увеличении микроскопа микропрепараты, окрашенные на липиды осмиевой кислотой. Зарисовать одну клетку, указать, что нейтральные липиды выявляются в клетках при фиксации тканей осмиевой кислотой в виде мелких и крупных капель черного цвета.

Отметить, что липиды выявляются также веществами, растворимыми в них, например, судановыми красителями (судан черный, судан красный). Это органические красители, имеющие сложный состав.

Работа № 8. Выявление комплекса Гольджи.

Рассмотреть клетки, в которых комплекс Гольджи имеет черную окраску (импрегнация солями серебра или осмиевой кислотой). Он располагается обычно около ядра или вокруг клеточного центра, однако его локализация может изменяться в связи с функциональной активностью клетки. Зарисовать одну клетку и отметить локализацию комплекса Гольджи.

Работа № 9. Выявление митохондрий.

Рассмотреть под микроскопом митохондрии (окраска по Альтману). Они имеют вид красных гранул, палочек, колбочек. Зарисовать одну клетку с митохондриями.

 

Записать в тетради: Качественные реакции на различные компоненты клетки.

Выявляемые компоненты клетки	Цитохимическая реакция	Характер выявления
ДНК в ядрах	Фельгена (реактив Шиффа – фуксин-сернистая кислота)	сиренево-фиолетовые глыбки в ядре
РНК	Браше (метиленовый зеленый – пиронин)	малиново-красные гранулы в цитоплазме и окрашенные ядрышки
Гликоген	Шик-реакция (Шифф-йодной кислотой)	Темно-вишневые глыбки в цитоплазме
Липиды	Осмиевая кислота	Включения в виде капель черного цвета
Комплекс Гольджи	Осмиевая кислота	Черные гранулы, извитые нити
Митохондрии	По Альтману (гематоксилин и кислый фуксин)	Гранулы, палочки красного цвета
Клеточный центр	Железный гематоксилин	2 черные центриоли и ахроматиновые нити

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

для студентов 1 курса педиатрического факультета к занятию № 1.1.3. по теме: «Организация генетического материала»

Цель занятия: Увидеть видоспецифичность кариотипов различных позвоночных и научиться идентифицировать хромосомы человека. Научиться анализировать кариотип человека, используя метод дифференциального окрашивания, по которому можно идентифицировать каждую хромосому.

В итоге занятия студент должен знать: Строение и принципы классификации хромосом. Понятие о кариотипе.

В итоге занятия студент должен уметь: Идентифицировать хромосомы по кариограммам и атласам, содержащим Парижскую номенклатуру хромосом.

Вопросы для самоподготовки:

1. Организация клеточного ядра. Роль ядра в обеспечении жизненных процессов в эукариотических клетках.

2. Особенности молекулярной структуры ДНК, особенности репликации ДНК.

3. Строение и функция хромосом. Правила хромосом.

4. Почему при микроскопии исследователь видит Х-образные хромосомы?

5. Чем отличаются гетеро- и эухроматиновые участки хромосом?

6. Принцип классификации хромосом. (Денверская и Парижская классификации, их отличия, преимущество Парижской классификации).

7. Кариотип – индивидуальный признак вида. Идиограмма.

Литература для подготовки:

Основная: Учебник по биологии. Под ред. В.Н. Ярыгина, 2008, 1 т, c. 117-148.

Рекомендуемая:

1. Учебник по биологии. Под ред. В.Н. Ярыгина, 1984, с. 35-47

2. Учебник по биологии А.А. Слюсарева, с. 27-33, с. 117-118.

Практическая работа:

Работа № 1. Хромосомный уровень организации наследственного материала.

1.1. Строение хромосом.

Пользуясь микропрепаратами и таблицами, рассмотреть строение хромосомы. Зарисовать и обозначить ее компоненты (центромера, плечи (короткое – p, длинное – q), хроматиду).

 

 

1 – 2 – 3 – 4 –

1.2. Хромосомный набор человека.

Рассмотреть под иммерсионным увеличением метафазную пластину из культуры лейкоцитов крови человека, подсчитать общее число хромосом, отметить их тип. Зарисовать 3 типа хромосом: мета-, субмета-, акроцентрическую, обозначить плечи хромосом и центромеру.

 

 

Основные типы хромосом человека (зарисуйте и отметьте положение центромеры):

–

–

–

 

1.3. Кариотипы различных животных и растений.

Рассмотреть фотографии с хромосомным набором макака-резус, крысы, лосося, мухи дрозофилы, определить число и структуру. Сделать записи об особенностях кариотипа в отличие от кариотипа человека.

Вывод: запишите вывод о видоспецифичности хромосом различных организмов.

Работа № 2. Идентификация хромосом человека согласно Денверской классификации.

Пользуясь раздаточным материалом – таблицами со стандартным кариотипом человека, измерить с помощью линейки короткое и общую длину хромосом кариотипа, принимая во внимание, что длина первой хромосомы равна 10 мкм, а рисунок кариотипа сделана таким образом, что первая пара хромосом равна 20 мм. Следовательно, для перевода длины хромосом в мкм необходимо полученные величины по измерению хромосом на фотографиях в мм уменьшить в 2 раза (2мм – 1мкм).

У хромосом высчитывается абсолютная длина – в мкм и центромерный индекс – отношение короткого плеча к длине всей хромосомы, выраженная в процентах. Затем с плаката или прилагаемой таблицы перевести все стандартные параметры всех хромосом человека. В конце работы следует отметить, что по данным параметрам (абсолютная длина и центромерный индекс) возможно идентифицировать все хромосомы кариотипа человека. Кроме того, в тетрадях необходимо записать таблицу, где следует отметить число крупных, средних и мелких акро-, субмета-, и метацентрических хромосом. Крупные 10-7,5 мкм, средние 7-4 мкм, мелкие 3,9-2 мкм.

	Акроцентрические ЦИ=19-30	Субметацентрические ЦИ=31-39	Метацентрические ЦИ=40-48
Крупные 10-7,5мкм
Средние 7-4мкм
Мелкие 3,9-2мкм

 

 

Необходимо указать отличительные признаки набора мужских и женских хромосом.

 

ПАРАМЕТРЫ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

Группа хромосом	A	B	C	D	Е	F	G	X	Y
№	1-3	4, 5	6-12	13-15	16-17	19, 20	21, 22
средн.	ср.	ср.	ср.	ср.	ср.	ср.	ср.	ср.	ср.
Абсолютная длина в мкм
Длина короткого плеча (p)
Центромерный индекс (α)

Короткие плечи хромосом (р) 13,14,15 = 0,8 мкм; 21,22 = 0,6 мкм; Y = 0,5 мкм.

Работа № 3. Идентификация хромосом человека по Парижской системе классификаций.

Посмотреть метафазную пластинку дифференциально окрашенных хромосом человека (демонстрация). Проанализировать дифференциально окрашенный хромосомный набор человека на фотографии.

Зарисовать в тетради первую хромосому кариотипа человека, отметить гетеро- и эухроматиновые участки. Отметить и записать преимущества Парижской классификации перед Денверской классификацией.

Работа № 4. Политенные хромосомы.

Рассмотреть при большом увеличении микроскопа препарат слюнных желез личинок комаров и отметить их исчерченность. Зарисовать: на рисунке обозначить светлые зоны – эухроматиновые, интенсивно окрашенные зоны – гетерохроматиновые и пуфы-вздутия. Отметить и записать их функциональную значимость.

 

Вопросы к коллоквиуму