Кислотно-основные свойства аминокислот

α-Аминокислоты в силу своего химического строения проявляют кислотно-основные (амфотерные) свойства, которые определяют многие физико-химические и биологические свойства белков. На этих свойствах основаны, почти все методы выделения и идентификации аминокислот и белков.

При нейтральном значении рН аминокислоты в растворах нахо­дятся в виде биполярного иона (цвиттер-иона), при этом аминогруппа протонирована (-NH₃⁺), а карбоксильная группа - диссоциирована (-СОО^-):

(рН ≈7)

Ионизация аминокислоты зависит от рН среды: в кислых раство­рах ионизирована аминогруппа, а в щелочных - карбоксильная группа:

(рН=1)	(рН=11)

В кислой среде α-аминокислоты выступают как основания (по аминогруппе), а в щелочной - как кислоты (по карбоксильной группе). У некоторых аминокислот может ионизироваться также радикал (R), в связи, с чем все аминокислоты можно разделить на заряженные и незаря­женные (при физиологическом значении рН=6,0 - 8,0) (см. табл. 4). В качестве примера первых можно привести аспарагиновую кислоту и ли­зин:

Аспарагиновая кислота (отрицательно заряженная кислота, проявляет кислотные свойства)	Лизин (положительно заряженная кислота, проявляет основные свойства)

 

Если радикалы аминокислот нейтральные, то они не оказывают влияния на диссоциацию α-карбоксильной или α-аминогруппы, и вели­чинырК (отрицательный логарифм, показывающий значение рН, при котором эти группы наполовину диссоциированы) остаются относительно постоянными.

Величины рК для α-карбоксилыюй (pK₁) и α-аминогруппы (рК₂) сильно различаются. При рН < pK₁ почти все молекулы аминокислоты протежированы и заряжены положительно. Напротив, при рН > рК₂ прак­тически все молекулы аминокислоты являются отрицательно за­ряженными, так как α-карбоксильная группа находится в диссоции­рованном состоянии.

Следовательно, в зависимости от рН среды аминокислоты имеют суммарный нулевой положительный или отрицательный заряд. Значение рН, при котором суммарный заряд молекулы равен нулю, и она не перемещается в электрическом поле ни к катоду, ни к аноду, называется изоэлектрической точкой и обозначается pI.

Для нейтральных α-аминокислот значение pI находят как сред­нее арифметическое между двумя значениями рК:

При рН раствора меньше pI аминокислоты протонируются и, за­ряжаясь положительно, перемещаются в электрическом поле к катоду. Обратная картина наблюдается при рН > pI.

Для аминокислот, содержащих заряженные (кислотные или ос­новные) радикалы, изоэлектрическая точка зависит от кислотности или основности этих радикалов и их рК (рК₃). Значение pI для них находят по следующим формулам:

для кислых аминокислот:

для основных аминокислот:

В клетках и межклеточной жидкости организма человека и жи­вотных рН среды близко к нейтральному, поэтому основные аминокисло­ты (лизин, аргинин) имеют положительный заряд (катионы), кислые ами­нокислоты (аспарагиновая, глутаминовая) имеют отрицательный заряд (анионы), а остальные существуют в виде биполярного цвиттер-иона.

Стереохимия аминокислот

Важной особенностью белковых α-аминокислот является их оп­тическая активность. За исключением глицина все они построены асим­метрично, в связи с чем, будучи растворены в воде или в соляной кисло­те, способны вращать плоскость поляризации света. Аминокислоты суще­ствуют в виде пространственных изомеров, относящихся к D- или L-ряду. L- или D-конфигурация определяется типом строения соединения относительно асимметрического атома углерода (атом углерода, свя­занный с четырьмя различными атомами или группами атомов). В фор­мулах асимметрический атом углерода обозначают звездочкой. На рис.3 показаны проекционные модели L- и D- конфигураций аминокислот, ко­торые являются как бы зеркальным отображением друг друга. Все 18 оптически активных белковых аминокислот относятся к L -ряду. Однако в клетках многих микроорганизмов и в антибиотиках, продуцируемых некоторыми из них, обнаружены D-аминокислоты.

Рис. 3. Конфигурация L- и D- аминокислот

Строение белков

Исходя из результатов изучения продуктов гидролиза белков и выдвинутых А.Я. Данилевским идей о роли пептидных связей -CO-NH- в построении белковой молекулы, немецкий ученый Э.Фишер предложил в начале XX века пептидную теорию строения белков. Согласно этой тео­рии, белки представляют собой линейные полимеры α-аминокислот, свя­занных пептиднойсвязью - полипептиды:

В каждом пептиде один концевой аминокислотный остаток имеет свободную α-аминогруппу (N-конец), а другой - свободную α-карбок­сильную группу (С-конец). Структуру пептидов принято изображать, на­чиная с N-концевой аминокислоты. При этом аминокислотные остатки обозначаются символами. Например: Ala-Tyr-Leu-Ser-Tyr- ••• - Cys. Этой записью обозначен пептид, в котором N-концевой α-аминокислотой яв ­ ляется аланин, а С-концевой - цистеин. При чтении такой записи окончания названий всех кислот, кроме последних меняются на - "ил": аланил-тирозил-лейцил-серил-тирозил-••• -цистеин. Длина пептидной цепи в пептидах и белках, встречающихся в организме, колеблется от двух до сотен и тысяч аминокислотных остатков.

Для определения аминокислотного состава белки (пептиды) подвергают гидролизу:

В нейтральной среде эта реакция протекает очень медленно, но ускоряется в присутствии кислот или щелочей. Обычно гидролиз белков проводят в запаянной ампуле в 6М растворе соляной кислоты при 105 °С; в таких условиях полный распад происходит примерно за сутки. В неко­торых случаях белок гидролизуют в более мягких условиях (при темпера­туре 37-40 °С) под действием биологических катализаторов-ферментов в течение нескольких часов.

Затем аминокислоты гидролизата разделяют методом хромато­графии на ионообменных смолах (сульфополистирольный катионит), вы­деляя отдельно фракцию каждой аминокислоты. Для вымывания аминокис­лот с ионнообменной колонки используют буферы с возрастающим зна­чением рН. Первым снимается аспартат, имеющий кислотную боковую цепь; аргинин с основной боковой цепью вымывается последним. После­довательность снятия аминокислот с колонки определяют по профилю вымывания стандартных аминокислот. Фракционированные аминокислоты определяют по окраске, образующейся при нагревании с нингидрином:

В этой реакции бесцветный нингидрин превращается; в синефиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570 нм) пропорциональна количеству аминокислоты (только пролин дает желтое окрашивание). Измерив, интенсивность окрашивания, можно рассчитать концентрацию каждой аминокислоты в гидролизате и число остатков каждой из них в исследуемом белке.

В настоящее время такой анализ проводят с помощью автомати­ческих приборов - аминокислотных анализаторов (см. ниже рис. Схемы прибора). Результат ана­лиза прибор выдаёт в виде графика концентраций отдельных аминокис­лот. Этот метод нашел широкое применение в исследовании состава пищевых веществ, клинической практике; с его помощью за 2-3 часа можно получить полную картину качественного состава амино­кислот продуктов и биологических жидкостей.

Рис. Схема аминокислотного анализатора: 1 - вымывающий раствор (буфер с переменным рН); 2 - хроматогрифическая колонка (в верхнюю часть колонки вносят гидролизат белка, затем начинают вымывание); 3 - раствор нингидрина; 4 - водяная баня (подогревание необходимо для ускорения реакции нингидрина с аминокислотами); 5 - спектрофотометр и записывающее устройство; 6 - хроматограмма, каждый пик которой соответствует одной ами­нокислоте, а площадь пика пропорциональна концентрации аминокислоты в гидролизате.