Мишур И. И.
Грабовская О. С.
Гурский Д. А.
Гель электрофорез в присутствии SDS.
Исходные растворы.
1. Раствор мономеров.
2. Буфер разделительного геля.
3. Буфер фокусирующего (концентрирующего геля) геля.
4. Электродный буфер.
5. Персульфат аммония (NH4)2S2O8. Хранение в холодильнике при +4оС.
6. ТЕМЕД-реактив стабилен при хранении в холодильнике в неразбавленном виде.
7. Трихлоруксусная кислота (ТХУ) -10%.
8. Отмывочная смесь- этанол: Н2О: уксусная кислота = 5:5:1
9. Уксусная кислота - 7%.
10. Кумасси G-250 - 40мг на 100мл 3.5% раствора НСlО4. Растворение красителя проводят на магнитной мешалке 30мин, после чего обязательно фильтруют через бумажный фильтр.
11. Набор белков маркеров с известной молекулярной массой.
Подготовка образцов.
Растворы опытных образцов берут в расчете, что нагрузка на одну трубочку составляет от 10 до 200 мкг по белку. Оптимальная концентрация - 150мкг по белку.
Смесь, состоящую из:
0.100 мл исследуемого раствора
0.04 мл диссационной смеси - 10% раствор SDS в 25% b-меркаптоэтаноле.
0.03 мл БФГ.
0.03 мл глицерина.
выдерживают 2 мин. на водяной бане при температуре 100оС.
Проведение электрофореза.
3.Определение молекулярной массы белков методом гель электрофореза.
При проведении электрофореза в трубочках часто трудно получить хорошо воспроизводимые результаты на разных трубочках. В этом случае определяют не абсолютную, а относительную подвижность белков.
Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс - отношение пробега белка маркера к длине пробега лидирующего красителя, а по оси ординат - логарифм его молекулярной массы.
Определив длину пути, пройденного белком с неизвестной молекулярной массой lx, пользуясь калибровочным графиком, определяют молекулярную массу исследуемого белка.
Определение молекулярной массы химотрипсиногена.
По результатам денситограммы (стандарты) определили:
Rf=1.8/7.1=0.25 – бычий сывороточный альбумин
Rf=3.1/7.1=0.44 – яичный альбумин
По результатам денситограммы (химотрипсиноген) определили:
Rf=4.8/6.8=0.71 – химотрипсиноген
По результатам денситограммы (смесь проферментов) определили:
Rf1=1.7/6.8=0.25
Rf2=2.3/6.8=0.34
Rf3=3.5/6.8=0.52
Rf4=4.2/6.8=0.62
Rf5=4.8/6.8=0.71 – химотрипсиноген
Для построения градуировочного графмка использовали следующие образцы: бычий сывороточный альбумин (66000 Да), яичный альбумин (45000 Да).
Молекулярная масса химотрипсиногена равна 27815 Да.
Метод определения протеолитической активности (модифицированный метод Ансона)
Сущность метода.
Метод основан на гидролизе белка казеината натрия препаратом фермента, находящимся в исследуемом растворе, с последующей инактивацией фермента и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ).
Приготовление раствора ферментного препарата.
Приготовить исходный раствор химотрипсина с концентрацией 1 г в 15 мл. Определить концентрацию белка в исходном растворе химотрипсина, измерив оптическую плотность раствора при 280 нм. (E1%1cv = 20,0)
Условия гидролиза.
Ферментативный гидролиз проводят, используя раствор с массовой долей белка-субстрата 1% (после смешивания раствора субстрата и раствора фермента) в течение 10 мин. при (30,0 + 0,2)0С.
Перед проведением ферментативной реакции растворы фермента и субстрата следует термостатировать.
Проведение испытания.
Для каждого разведения по 2 мл субстрата и определенное количество буфера (см.таблицу) вливают в две пробирки и помещают в ультратермостат при (30,0 + 0,2)0С.
Примерно через 10 мин. в каждую пробирку наливают определенное количество исходного раствора фермента, пробирки встряхивают и оставляют на гидролиз ровно, на 10 мин. при (30,0 + 0,2)0С. Ровно через 10 мин. добавляют в обе пробирки по 4 мл раствора трихлоруксусной кислоты концентрацией 0,3 моль/литр, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза. Быстро перемешивают смесь и для обеспечения полного осаждения выдерживают пробирки со смесью при (30,0 + 0,2)0С еще 20 мин. и затем центрифугируют. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен. Затем отбирают в пробирки по 1 мл фильтрата, добавляют по 5 мл раствора углекислого натрия концентрацией 0,5 моль/литр, перемешивают и быстро при непрерывном перемешивании приливают по 1 мл рабочего раствора реактива Фолина. Дают реакционной смеси постоять 20 мин. После реакции растворы приобретают голубую окраску, интенсивность которой определяют спектрофотометрически против контрольной пробы.
Контрольный опыт готовят, прибавляя реактивы к в обратной последовательности: для этого к смеси буфера и исходного ферментного раствора в количествах, как и в опыте, добавляют 4 мл ТХУ, выдерживают в термостате при (30,0 + 0,2)0С 10 мин, а затем вносят 2 мл субстрата. Через 20 мин нахождения в термостате раствор фильтруют, отбирают в сухую пробирку 1 мл фильтрата, при перемешивании вносят 5 мл раствора углекислого натрия концентрацией 0,5 моль/литр и 1 мл рабочего реактива Фолина. Колориметрирование производят спектрофотометром "Shimadzu UV-1202" в диапазоне длин волн 630-670 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
| № опыта | V буфера, мл | V ферментного раствора, мл |
| 1,9 | 0,1 | |
| 1,6 | 0,4 |
Обработка результатов.
Протеолитическую активность в ед/г или ед/мл вычисляют по формуле
D * 4 * 1000
А = —————————
M
где D - оптическая плотность, измеренная спектрофотометрически.
4 - отношение объемов реакционной смеси и раствора фермента после добавления ТХУ.
1,15 - тирозиновый эквивалент.
10 - время гидролиза субстрата, мин.
m - количество ферментного препарата, взятого на протеолиз (в мг)
1000 - переводной коэффициент полученных единиц на 1 г ферментного препарата.
m1= 0,03 мг
m2 = 0,12 мг
0,075 * 4 * 1000
А1 = ————————— = 869,6 ед/г
1.15 * 10 *0,03
0,124 * 4 * 1000
А2 = ————————— = 359,4 ед/г
1.15 * 10 *0,12
Результаты лабораторной работы оформляем в виде таблицы.
D (8,2 мг/3 мл) = 1,26
1% – 20 х = 0, 063% = 0 063 г/100 мл
х – 1,26
0,063 – 100 мл х = 0,00189 г = 1,89 мг (23% от 8,2 мг).
х – 3 мл
17,9* 0,23 = 4,117 г 2,415* 0,335 = 1,379 (г)
D (14,2 мг/3 мл) = 3,18
1% – 20 х = 0,159% = 0,159 г/100 мл
х – 3,18
0,0159 – 100 мл х = 0,00477 г = 4,77 мг (33,59 % от 14,2 мг).
х – 3 мл
2,3* 0,3359 = 0,7725 г 0,7725 *0,92 = 0,7107 (г)
| Стадия выделения | m, г | mбелка, г | Mхимотрипсинагена, г | % |
| Исходная поджелудочная железа | ––– | ––– | ––– | |
| Смесь проферментов | 17,9 | D280 нм (8,2 мг/3 мл) = 1,26 | 1,379 | |
| Химотрипсиноген | 2,3 | D280 нм (14,2 мг/3 мл) = 3,18 | 0,7107 | 51,54 |
