(для студентов)
Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический
Курс: 2
1. Тема занятия: Ферменты: строение и свойства.
2. Учебная цель занятия: Изучить особенности строения и основные свойства ферментов, методы определения их активности.
3. Задачи занятия:
1. на основе знаний по биоорганической химии систематизировать сведения о строении и основных свойствах белков, их биологической (каталитической) роли в организме.
2. изучить строение ферментов, знать отличия в строении простых и сложных ферментов, локализацию ферментов в клетке, изоферменты.
3. познакомиться с основными методами качественного обнаружения и количественного определения активности ферментов.
4. в ходе выполнения практической работы познакомиться с методами осаждения белков, обнаружить кофермент НАД в дрожжах, исследовать амилазную активность слюны.
4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.
5. Задание студентам:
1. Изучить денатурацию белков под действием растворов минеральных и органических кислот и при нагревании.
2. Обнаружить кофермент НАД в дрожжах.
3. Определить амилазную активность в моче (сыворотке крови).
6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.
Работа № 1. Денатурация белков под действием кислот и при нагревании.
Принцип метода: денатурация - это нарушение структурной организации белковой молекулы, приводящее к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Большинство белков теряют биологическую активность в присутствии сильных минеральных и органических кислот, при обработке ПАВ, органическими растворителями, солями тяжелых металлов и под действием физических факторов (температура, ультразвук, радиация). Денатурации предшествует нарушение гидратной оболочки и снятие заряда белка, в силу чего он становится менее гидрофильным и легко осаждается.
Ход работы:
1). Осаждение белка минеральными кислотами.
В пробирку наливают 15-20 капель концентрированной азотной кислоты (HNO3) и осторожно по стенке приливают равный объем раствора белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде небольшого белого кольца.
2). Осаждение белка органическими кислотами.
В пробирку наливают 5-10 капель раствора белка и добавляют 3-5 капель 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Образуется осадок белка.
3). Осаждение белка при нагревании.
В пробирку наливают 5-10 капель раствора белка и содержимое пробирки нагревают над спиртовкой, Жидкость мутнеет.
Клинико-диагностическое значение.
Осаждение белка с помощью ТХУ широко используется в клинической практике для обнаружения белка в биологических жидкостях (моча, экссудаты и др.).
В клинической практике выполнению анализа сыворотки крови на содержание малых молекул (глюкоза, мочевая кислота и т.д.) предшествует осаждение белков действием минеральных кислот или ТХУ.
Способность белка прочно связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимого осадка используется как противоядие при отравлениях солями тяжелых металлов.
Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов
В выводах отразить причины осаждения белков из растворов, влияние денатурирующих факторов на активность ферментов.
Работа № 2. Обнаружение никотинамидадениндинуклеотида (НАД) в дрожжах.
Принцип метода: В процессе тканевого дыхания водород от оксиляемого субстрата с помощью ферментов дегидрогеназ переносится на коферменты ФАД или НАД+. НАД+ - кофермент, содержащий витамин РР, встречается во многих тканях и органах человека и животных, много его и в дрожках. Этот кофермент легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флуоресцирующего комплекса с ацетоном.
Ход работы: В пробирку помещают кусочек дрожжей величиной 4-5 мм, добавляют 1/3 пробирки воды и кипятят 20-З0 С, не допуская выброса жидкости. В пустую пробирку отфильтровывают 5-10 капель полученного экстракта и добавляют туда 3-5 капель ацетона, 1-2 капли раствора фенолфталеина и по каплям соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина, встряхивая при этом пробирку. Помещают пробирку на 2 мин в кипящую водяную баню, после чего вынимают, охлаждают и подносят к включенному флюорометру. Ацетоновый комплекс флюоресцирует синим цветом.
Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов
1. Приведите структурную формулу кофермента НАД, выделив его рабочий фрагмент.
2. Напишите в общем виде реакцию дегидрирования субстрата с участием НАД+.
Работа № 3. Определение амилазной активности в моче (крови) методом Каравея со стойким крахмальным субстратом.
Принцип метода: α-амилаза гидролизует крахмал с образованием продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности α-амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.
Ход работы: (микрометод). 0,5 мл субстратно-буферного раствора помещают в пробирку, нагревают 5 мин при 37˚С, добавляют 0,01 мл исследуемой биологической жидкости. Инкубируют 7,5 мин при 37˚С. Время инкубации необходимо точно отсчитывать по секундомеру с момента добавления биологической жидкости в крахмальный субстрат. Тотчас же после инкубации добавляют 0,5 мл 0,01 Н раствора йода и доводят объем дистиллированной водой до 5 мл. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) против дистиллированной воды.
Расчет. Активность α-амилазы выражают в мг или г крахмала, гидролизованного 1 л биологической жидкости за 1 с инкубации при 37˚С. Расчет проводят по формуле:
А=((ЕК-ЕО)/ЕК) • (0,2 • 105/7,5 • 60) или А=((ЕК-ЕО)/ЕК) • 44,4, где
А – активность α-амилаза, мг/(с•л),
ЕК – экстинция контрольной пробы,
ЕО – экстинция опытной пробы,
0,2 – количество, крахмала введенного в опытную и контрольную пробы, мг.
105 – коэффициент перерасчета на 1 с инкубации.
Нормальные значения. Сыворотка крови: 3,3-8,9 мг/(с•л), Моча: до 44 мг/(с•л).
Клинико-диагностическое значение. Повышение активности α-амилазы в крови и моче наблюдается при остром панкреатите (до 90% и более), а также при вирусном гепатите и раке поджелудочной железы. Труднообъяснимую гиперамилаземию вызывают холецистит, перитонит, ожоги, острый аппендицит. Употребление многих фармакологических препаратов (кортикостероиды, салицилаты, тетрациклин, гистамин) приводит к повышению уровня активности α-амилазы. При почечной недостаточности α-амилаза в моче отсутствует.
Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов
Результаты работы оформите в виде таблицы:
| Название фермента | α-амилаза |
| Исследуемый материал | |
| Субстрат | |
| Условия определения | фосфатный буфер; рН 7,0; 37°С (по убыли крахмала) |
| Найденная активность α-амилаза | |
| Активность α-амилазы в норме | |
| Вывод |
В выводе сравните найденное значение амилазной активности с нормой и выскажите предположение о возможных причинах отклонения, если таково выявлено.
7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).
8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).
9. Обсуждено на заседании кафедры 29. 08. 2011 г.
10. Учебное задание подготовлено
ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
кафедра биохимии
Утверждаю
Зав. каф. проф., д.м.н.
Мещанинов В.Н.
_____‘’_____________2011 г
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
