Методы выделения и очистки белков

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

ТАМБОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Г.Р. ДЕРЖАВИНА

 

 

А.В. Гулин

С.Е. Синютина

А.Г. Шубина

 

БИОХИМИЯ

(часть 1)

 

Допущено Редакционно-издательским

советом ТГУ имени Г.Р. Державина в качестве

учебного пособия для студентов,

обучающихся по специальностям

060101.65 – Лечебное дело

060103.65 – Педиатрия

060105.65 – Стоматология

 

Тамбов 2014

УДК ББК Г

 

 

Рецензенты:

Доктор медицинских наук, профессор С.Н. Симонов

Доктор биологических наук, профессор Е.В. Малышева

С	Гулин, А.В. Биохимия (часть 1): Учебное пособие для студентов университетов, обучающихся по специальностям «Лечебное дело», «Педиатрия», «Стоматология» / А.В. Гулин, С.Е. Синютина, А.г. Шубина; Министерство образования и науки РФ, Тамб. гос. ун-т им. Г.Р. Державина, Тамбов: Издательский дом ТГУ им. Г.Р. Державина, 2014. - с.
	УДК ББК   © Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, 2014

СОдержАНИЕ

	С.
Предмет биохимии
1. Химия белков
1.1. Методы выделения и очистки белков
1.2. Функции белков
1.3. Аминокислотный состав белков
1.4. Структурная организация белков
1.5. Физико-химические свойства белков
1.6. Классификация белков
1.6.1. Простые белки
1.6.2. Сложные белки
2. Ферменты
2.1. Химическая природа ферментов
2.2.Механизм действия ферментов
2.3. Кинетика ферментативных реакций
2.4. Свойства ферментов
2.5. Регуляция активности ферментов
2.6. Классификация и номенклатура ферментов
2.7. Ферменты в медицине
3. Витамины
3.1. Жирорастворимые витамины
3.2. Водорастворимые витамины
4. Основные принципы организации биомембран
4.1. Строение и функции мембран
4.2. Транспорт веществ через мембрану
5. Механизмы передачи гормонального сигнала
6. Введение в метаболизм
6.1. Общая схема катаболизма
6.2. Биоэнергетика
6.3. Организация и функционирование дыхательной цепи
6.4. Разобщение дыхания и фосфорилирования
6.5. Микросомальное окисление
6.6. Антиоксидантная система
6.7. Реакции общего пути катаболизма
6.7.1. Окислительное декарбоксилирование ПВК
6.7.2. Цикл трикарбоновых кислот
7. Обмен углеводов
7.1. Переваривание углеводов
7.2. Обмен гликогена
7.3. Гликолиз
7.4. Включение фруктозы и галактозы в гликолиз
7.5. Челночные механизмы
7.6. Цикл Кори
7.7. Спиртовое брожение
7.8. Пентозофосфатный путь превращения глюкозы
7.9. Глюконеогенез
7.10. Регуляция обмена углеводов
7.11. Нарушения углеводного обмена
Литература

ПРЕДМЕТ БИОХИМИИ

Биохимия – наука о химических основах процессов жизнедеятельности, изучающая химические компоненты живых клеток, а также реакции и процессы, в которых они участвуют. Предметом медицинской биохимии являются химические процессы, происходящие в организме человека в норме и при патологии.

Основная цель биохимии - изучение молекулярных основ физиологических функций человека в норме с учетом онтогенеза, молекулярных механизмов развития патологических процессов, предупреждения и лечения болезней, биохимических методов диагностики болезней и контроля состояния здоровья человека.

Ряд выдающихся открытий в биохимии и в некоторых ее разделах – энзимологии, биохимической генетике, молекулярной биологии, биоэнергетике и др., - выдвинули ее в раздел фундаментальных научных дисциплин, сделав орудием решения многих важных проблем биологии и медицины.

ХИМИЯ БЕЛКОВ

Белки - высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки называют также протеинами (от греч. рrotos – первый). Свое название они получили, когда в тканях животных и растений были обнаружены вещества, имеющие сходство с белком куриного яйца.

Белки составляют основу и структуры, и функций живых организмов. Природные белки построены из 20 различных аминокислот. Эти аминокислоты могут объединяться в самой разной последовательности, поэтому способны образовывать порядка 10¹⁸ разнообразных белков. Белки обеспечивают существование около 10⁶ видов живых организмов, начиная от вирусов и заканчивая человеком. Каждый организм характеризуется уникальным набором белков.

Содержание белков в различных тканях одного организма неодинаково. Так, в организме человека содержится белков в % от сухой массы: в мышцах – 80, в мозге – 45, в костях – 20.

Элементный состав белков в пересчете на сухое вещество, %: С - 50-54; Н - 6,5-7,3; О - 21-23; N - 15-17; S - до 0,5. В составе некоторых белков в небольших количествах содержатся фосфор, железо, марганец, магний, йод и др. Содержание азота относительно постоянно во всех белках (около 16%), поэтому по белковому азоту можно определять количество белка в биологических объектах.

 

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

Белки под действием различных факторов (действие химических реагентов, нагревание и др.) легко подвергаются денатурации: происходит разрушение нативной структуры белков, приводящее к потере некоторых природных свойств, например, растворимости, биологической активности. Поэтому для выделения белков разработаны специальные «щадящие» методы.

Процесс начинают с гомогенизации биологического материала – измельчения до разрушения клеточных структур. Для этого используют пестиковые или ножевых гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, метод «азотной бомбы».

Затем проводят экстракцию белков буферными смесями с определенными значениями рН, органическими растворителями. Большинство белков хорошо растворимо в 8-10% растворах солей.

Для фракционирования и очистки белков используют следующие методы.

Высаливание – осаждение белков при добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов. В клинической практике этот метод используют для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении раствора сульфата аммония) и альбуминов (при 100% насыщении).

Электрофорез основан на различной подвижности белков в электрическом поле в зависимости от значений рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови.

Ультрацентрифугирование - метод разделения жидких дисперсных сред на компоненты под действием центробежной силы.

Хроматография - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент). В клинических лабораториях хроматографию применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.

Различают следующие виды хроматографии:

- адсорбционная – компоненты смеси разделяются в зависимости от их сорбируемости на твердом адсорбенте;

- распределительная - твердая фаза является опорой для стационарной жидкой фазы (бумажная хроматография);

- ионообменная - используют ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются из колонки;

- гель-хроматография или метод молекулярных сит позволяет разделить белки с разной молекулярной массой: небольшие молекулы проникают в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой через хроматографическую колонку.

Перспективными видами хроматографии являются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография.

 

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Структурная функция. В комплексе с липидами белки участвуют в образовании биомембран клеток. Структурные белки цитоскелета придают форму клеткам и многим органоидам. Примерами структурных белков являются коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже.

Сократительная (двигательная) функция. Сократительная функция присуща мышечным белкам (актин и миозин). Белки цитоскелета необходимы для расхождения хромосом в процессе митоза.

Питательная (резервная) функция. Белки яйца (овальбумины) - источники питания для плода. Основной белок молока (казеин) также выполняет питательную функцию.

Каталитическая функция. Большинство известных в настоящее время ферментов (биологических катализаторов) является белками.

Транспортная функция. Белок эритроцитов гемоглобин участвует в переносе кислорода и углекислого газа, выполняя дыхательную функцию. Альбумины сыворотки крови участвуют в транспорте липидов.

Защитная функция. В ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков синтезируются защитные белки - антитела (иммунная защита). Ряд белков плазмы крови способны к свертыванию, что предохраняет от кровопотери при ранениях (физическая защита).

Гормональная функция. Группа гормонов представлена белками или полипептидами, например, гормон поджелудочной железы инсулин.

Рецепторная функция. Клеточные белки образуют специфические рецепторы и участвуют в передаче гормонального сигнала.

Другие важные функции белков - способность поддерживать онкотическое давление в клетках и крови, буферные свойства, обеспечивающие физиологическое значение рН внутренней среды, и др.